Ortho-Nitrophenyl-Galactosid-Test an Bakterien, um ihre Fähigkeit zur Hydrolyse von Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactosid zu ermitteln

In diesem Artikel erfahren Sie mehr über die Leistung des Ortho-Nitrophenyl-Galactosid-Tests an Bakterien, um herauszufinden, ob sie in der Lage sind, Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactosid zu hydrolysieren!

Prinzip:

Einige Bakterien können Laktose fermentieren. Sie werden als "Laktose-fermentierende Bakterien" oder "Laktosefilter" bezeichnet.

Die anderen, die Laktose nicht fermentieren können, werden als Laktose-nicht-fermentierende Bakterien oder Laktose-Nicht-Erreger bezeichnet.

Die Laktose-fermentierenden Bakterien können zwei Enzyme produzieren, nämlich "Permease" und "β-Galactosidase", die an der Fermentation von Laktose beteiligt sind. Permease hilft beim Eintritt von Lactose in die Bakterienzellen, während β-Galactosidase Lactose zu Glucose und Galactose hydrolysiert, β-Galactosidase ist ein intrazellulär induzierbares Enzym, dessen Produktion durch die Anwesenheit von Lactose in der Umgebung der Bakterienzellen induziert wird.

Während laktosegärende Bakterien sowohl Permease als auch β-Galactosidase produzieren können, können nicht-fermentierende Laktose-Bakterien keine Permease erzeugen, aber möglicherweise β-Galactosidase. Der ONPG-Test wird durchgeführt, um herauszufinden, ob Laktose nicht fermentierende Bakterien β-Galactosidase produzieren können.

Dazu wird die Zellmembran der nicht-fermentierenden Laktosezellen durch Zugabe von Toluol aufgelöst, um alle intrazellulären Enzyme einschließlich der P-Galactosidase, falls vorhanden, freizusetzen. Das Enzym β-Galactosidase hydrolysiert das Substrat Orthonitrophenyl-β-D-Galctosid (ONPG) zu Ortho-Nitrophenol, das eine gelbe Farbe aufweist.

Im ortho-Nitrophenylgalactosid-Test (ONPG-Test) werden die Testbakterien auf dreifach Zucker-Eisenagar (TSI-Agar) -Schwanzen gezüchtet, die Laktose enthalten. Wenn die Bakterien eine Laktose sind, die nicht fermentiert ist, wie durch einen roten Hintern und eine rote Schrägstellung angezeigt, wird eine dicke Suspension der Bakterien in Salzlösung hergestellt, zu der Toluol und anschließend eine ONPG-Lösung gegeben wird. Wenn die Bakterien die Fähigkeit haben, das Enzym P-Galactosidase herzustellen, ändert sich die Farbe der Bakteriensuspension in Gelb.

Erforderliche Materialien:

Reagenzgläser, Erlenmeyerkolben, Wattestopfen, Impföse, Impfnadel, Autoklav, Bunsenbrenner, Laminar-Flow-Kammer, Entsorgungsgefäß, Inkubator, TSI-Agar, Toluol, Nitrophenyl-β-D-galactosid-Lösung (ONPG), isolierte Kolonien oder reine Bakterienkulturen.

Verfahren:

1. Die Inhaltsstoffe des TSI-Agarmediums (enthaltend 3 Zucker und Eisen als Hauptbestandteile) oder seines für 100 ml des Mediums erforderlichen Fertigpulvers werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben gelöst Schütteln und Wirbeln (Abbildung 7.16).

2. Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und unter Verwendung von 0, 1 N HCl auf 0, 1 eingestellt, wenn weniger als 0, 1 N NaOH verwendet wird.

3. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen.

4. Bevor es sich verfestigt, wird das Medium in warmem geschmolzenem Zustand in 5 Teströhrchen (jeweils ca. 20 ml) verteilt.

5. Die Reagenzgläser sind mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

6. Sie werden bei 121 ° C (15 psi Druck) 15 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert.

7. Nach der Sterilisation werden sie aus dem Autoklaven genommen und in einer schrägen Position gehalten, um das Medium abzukühlen und zu verfestigen, um TSI-Agar-Schrägen zu erhalten.

8. Die Testbakterien werden aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, in die Schrägen inokuliert, indem sie in den Kolben stechen und mit Hilfe einer flammensterilisierten Nadel auf der Oberfläche der Schrägen streifen. Die Nadel wird nach jeder Impfung sterilisiert.

9. Die inokulierten Schrägen werden 24 Stunden bei 37 ° C in einem Inkubator inkubiert.

10. Wenn das Bakterium ein Laktose-Fermenter ist, wird es nicht für den ONPG-Test ausgewählt. Wenn das Bakterium ein Laktose-nicht-Fermenter ist, wie durch roten Hintern und rote Schrägstellung angezeigt, wird es für den ONPG-Test ausgewählt.

11. In ein Reagenzglas mit 0, 25 ml Kochsalzlösung wird mittels einer flammsterilisierten Schleife eine dicke Kultur der Bakterien gegeben, um eine dicke Suspension der Bakterien herzustellen.

12. Ein Tropfen Toluol wird zugegeben, gemischt und 5 Minuten bei 37 ° C inkubiert.

13. O-Nitrophenylgalactosidlösung (ONPG-Lösung) wird zugegeben und 30 Minuten bei 37 ° C inkubiert. Dann wird die Farbänderung beobachtet. Wiederum wird nach 24 Stunden eine Farbänderung beobachtet.