Kryokonservierung von Gameten bei Fischen
In diesem Artikel werden wir über die Kryokonservierung von Gameten bei Fischen diskutieren.
Die Kryokonservierung ist eine Lagertechnik, die praktisch keine Zeitbegrenzung hat. Mit dieser Technik wurde der Erhalt von Fischgameten versucht. Die Kryokonservierung von Spermien ist ein etabliertes Verfahren in der Tierhaltung.
Kryokonservierte Spermien werden nun erfolgreich bei der Insemination von Rindern, Pferden, Schweinen, Schafen und Geflügel eingesetzt. Es ist interessant festzustellen, dass große Anstrengungen unternommen wurden, um diese Technologie auf die Erhaltung von Spermien, Eizellen und Embryonen von Fischen zu übertragen.
Diese Technik hilft den Fischzüchtern auf folgende Weise:
(1) Das Problem der nicht zufälligen Reifung von Mann und Frau kann überwunden werden, wenn Spermien oder Eizellen gelagert werden.
(2) Das Programm der selektiven Zucht kann durchgeführt werden, um die einheimischen Bestände zu verbessern und der Dritten Welt zu helfen, ihre einheimischen Arten zu züchten und spezielle Stämme von überlegenem Stiel zu erzeugen.
(3) Die Kryokonservierung von Gameten wird eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des einheimischen Keimplasmas spielen, da viele indigene indische Fische nicht mit exotischen Fischen konkurrieren können. Durch diese Technik werden die Gameten von bedrohten Arten als Absicherung gegen die durch Umweltstörungen verursachte schwindende genetische Variabilität abgesichert.
(4) Es kann bei der Produktion von Mono-Sex-Kultur helfen.
(5) Wenn Gameten erfolgreich konserviert werden können, können wir das ganze Jahr über Fische entwickeln, um die genetische Originalität der Population zu erhalten und zur Wiedereinführung zur Verfügung zu stellen, wenn sich die Überlebensbedingungen verbessert haben.
Die Spermien, Eier und Embryonen können kryokonserviert werden, die Konservierung von Eiern und Embryonen ist jedoch schwierig, da das Kryoprotektionsmittel aufgrund ihrer großen Größe im Vergleich zu Spermien nicht ausreichend in diesen Zellen aufgenommen werden kann.
Die Kryokonservierung von Spermatozoen bei Fischen ist beim Menschen erfolgreich; Arten Diese Arten sind Oncorhynchus, Salmo, Salvilinus fontinalis, Hucho hucho, Thymallus thymallus, Esox lucius und Cyprinus carpio, Serothodon mossambicus; Labeo rohita, Catla catla und Cirrhinus mrigala.
Bei der Konservierung von Spermatozoen sind folgende Schritte zu beachten:
(1) Milchsammlung (Samen).
(2) Herstellung einer Extenderlösung.
(3) Auswahl des Kryoprotektionsmittels.
(4) Einfrieren.
(5) Erfolg bei der Düngung.
Sammlung von Milt:
Der erste Schritt ist das Sammeln von Spermien. Normalerweise werden die Spermien von gesunden Fischen durch Strippen gesammelt. Der Katheter kann verwendet werden, was eine bessere Alternative zum Ablösen ist. Die männlichen Brüter mit den besten charakteristischen Merkmalen wurden ausgewählt und mit Ringers-Lösung gewaschen, und die Genitalpapillenregion wird getrocknet.
Der Brutapparat kann betäubt oder nicht betäubt werden. Im allgemeinen wird eine Anästhesie von 0, 3 ml / l Phenoxyethanol verwendet. Laut Kumar (1989) führt eine Injektion von Suston 250 (Organon) vor dem Strippen zu besseren Ergebnissen bei indischen Karpfen. Die Mehrheit der Arbeiter in diesem Bereich empfahl nicht anästhesierte Fische zum Abstreifen, um Milz zu erhalten.
Der Milz wird in Spritzen oder Hämolyseröhrchen gesammelt und später in Glasampullen (versiegelt oder nicht verschlossen), Plastikstrohhalmen und häufig in Plastiktüten aufbewahrt. Farbe, Volumen, Dichte, pH-Wert und Beweglichkeit der Spermien sind zu beachten.
Die Probe sollte frei von Harn und Fäkalien sein. Ein Abstrich der Probe ist unter dem Mikroskop zu untersuchen, um Abnormalitäten in Spermien festzustellen. Wenn die Probe in Ordnung ist, dann zur weiteren Verarbeitung geben, andernfalls können frische Proben von neuen Brutern entnommen werden.
Während der Zeit des Sammelns und Konservierens von Spermatozoen können die Spritze / Ampulle / das Stroh in Teichwasser gehalten werden, um die Temperatur konstant zu halten. Legendary und Billard (1980) sammelten die Spermien in Hämolyseröhrchen in schmelzendem Eis und lagerten sie dann auf einer gekühlten Oberfläche bei 4 ° C.
Für die Kryokonservierung ist die Vorbereitung und Auswahl des Extenders, einer Lösung, in der Milz gesammelt wird, von größter Bedeutung. Der Extender verhindert die Erschöpfung der Spermienergie und hält die Spermien in einem Zustand, der lebendig ist.
Es gibt zwei grundlegende Extender. Sie werden Mounibs medium (M) und Menezo medium (Me) genannt. In diesen beiden Medien werden Rinderserumalbumin (BSA) und Tellurit-Eigelb zugegeben. Bei indischen Fischen wurden mehrere Extender versucht, indem sie die folgenden Bestandteile modifizierten.
Die üblichen Bestandteile sind Natriumchlorid, KCl, CaCl 2, NaHCO 3, Na 2 HPO 4 und MgSO 4 . Zusätzlich dazu werden Nährstoffe und Glycin hinzugefügt, um die Kryokonservierung zu verbessern. Antibiotika wie Gentomycin oder Streptomycin werden bei Bedarf ebenfalls zu der Extender-Lösung gegeben.
Kryoprotektor:
Die Hauptfunktion des Kryoprotektionsmittels besteht darin, in die Zelle einzudringen und kann Spermien helfen, die Gefriertemperatur zu tolerieren. Das wichtigste und am weitesten verbreitete ist DSMO (Dimethylsulfoxid) und Glycerin. Harvey (1983) verwendete Methanol, DSMO und Glycerin in Kombination mit Milchpulver oder Eigelb.
Kryoschutzmittel und Streckmittellösung in einem festen Verhältnis, im Allgemeinen ein Teil Kryoschutzmittel und neun Teile Streckmittellösung, sind als Verdünnungsmittel bekannt. In diesem Verdünnungsmittel werden die Spermien zur weiteren Verarbeitung zum Einfrieren gesammelt.
Das Verdünnungsmittel (Kryoprotektivum + Extender + Spermien) wird in Polyvinylstrohhalme aufgenommen und die beiden Enden der Strohhalme sind versiegelt. Jetzt können sie eingefroren oder gekühlt werden. Der Milz kann gekühlt werden, die Temperatur wird zwischen 0 und 5 ° C gehalten. Während des Einfrierens werden CO 2 und flüssiger Stickstoff verwendet. Die Lagerung von Teleost-Milz (0 bis 50 ° C) wurde in Salmoniden intensiv untersucht.
Beim Einfrieren sollten viele Probleme wie Kälteschock, Bildung von intrazellulärem Eis und osmotischer Schock unter Kontrolle gebracht werden. Kryokonservierung bedeutet im Allgemeinen die Lagerung von Zellen oder Gewebe bei -196 ° C, der Temperatur von flüssigem Stickstoff (Abb. 22.1).
Zellverletzungen sollten kontrolliert werden. Im Allgemeinen treten drei Arten von Zellverletzungen auf. Der erste ist ein Kälteschock, der durch Abkühlung über Gefriertemperaturen verursacht wird. Dies ist für Eizellen wichtiger, für Spermien nicht sehr wichtig.
Dies tritt bis zu 0 ° C auf. Wenn die Temperatur von 0 ° C bis -80 ° C steigt, kommt es zu osmotischem Schock und zur Bildung von intrazellulärem Eis in Eizellen und Spermien. Für eine erfolgreiche Kryokonservierung werden diese Dinge kontrolliert.
Kurz gesagt, die Strohhalme mit Verdünnungsmittel werden in Kanister abgefüllt. Die Kanister, die Strohhalme halten, nachdem sie die Äquilibrierungsdauer verändert haben, werden zuerst in flüssigen Stickstoffdämpfen und dann in flüssigen Stickstoff bei einer Temperatur von -196 ° C eingetaucht. Legendra und Billard (1980) lagerten die Spermien von Regenbogenforellen in Trockeneis (festes CO 2 -79 ° C) oder in flüssigem Stickstoff bis zu 6 Monaten.
In einer Reihe von Süßwasserspezies wurde ein Gefrieren durch Pelletieren suspendierter Spermien in Trockeneis durchgeführt. Der Übergang von 0 ° C auf -70 ° C dauert etwa 2 Minuten, was eine Geschwindigkeit von 35 ° C / min ergibt. Da sinkt die Rate über - 60 ° C. Die besten Ergebnisse werden in flüssigem Stickstoff erzielt.
Auftauen:
Das Auftauen ist umgekehrtes Einfrieren. Das Auftauen erfolgt im Wasserbad bei Temperaturen zwischen 10 ° C und 60 ° C. Der Erfolg des gesamten Verfahrens hängt von der Beweglichkeit der Spermatozoen und der Befruchtung der Eizellen ab.
Stoss und Holtz (1982) haben die Beweglichkeit von Spermatozoen aus rosa Lachs von 30 Sekunden auf 10 Minuten erhöht, indem sie mit einer 120 nm NaHCO 3 -Lösung aktiviert wurden, zu der 1 BMX (3-Isobutyl-1-methylxanthium) hinzugefügt worden war. Kumar (1989) stellte fest, dass die Lagerdauer bei L. rohita und H. molitrix unter kryogenen Bedingungen etwa 20 Tage beträgt.
Die Eier von Salmo gairdeneri, Onchorhynchus kisutch und O.keta wurden durch Abstreifen entfernt und in Plastiktüten zusammen mit Coelomic Fluid versiegelt und unter Sauerstoff bei 1 ° C gehalten. Die Eier werden dann verteilt, um eine Schicht ein oder zwei Eier tief zu bilden.
Die Eier wurden dann mit der Streckmittellösung und dem Kryoprotektionsmittel auf ähnliche Weise wie zuvor für Spermien beschrieben gemischt. Laut Harvey und Kelley (1984) war die Lagerung von Eizellen in gefrorenen (gekühlten) Eizellen mäßig erfolgreich, wobei die Lagerzeiten in der Größenordnung von einigen Wochen durch Kühlung von sauerstoffhaltigen Eiern in Coelomic-Flüssigkeit erhalten wurden.
