Top 3 sequentielle Schritte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die folgenden Punkte zeigen die drei wichtigsten aufeinander folgenden Schritte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die sequentiellen Schritte sind: Denaturierung 2. Annealing 3. Erweiterung der DNA.
Schritt 1: Denaturierung:
Der erste Schritt ist die Denaturierung der DNA (sowohl Primer-DNA als auch native DNA). Die Trennung von zwei DNA-Strängen wird als Denaturierung bezeichnet, während das Zusammenbringen von zwei Ständen als Wiederanlagerung oder Hybridisierung bezeichnet wird (Abb. 48.1). Die Entdeckung der Denaturierung und Wiederanlagerung von DNA wurde von Marmor and Lane (1960) künstlich gemacht.
Demnach könnte die doppelsträngige DNA in zwei getrennte Einzelstränge (Denaturierung) durch Erhitzen bei hoher Temperatur (90-95 ° C) und Hybridisierung oder Verbinden von zwei DNA-Strängen (doppelsträngige DNA), die durch möglich sind, getrennt werden Abnahme der Temperatur (50-56 ° C).
Dies ist das Hauptprinzip, nach dem die PCR funktioniert. Das zweite Prinzip ist die Erweiterung des Primers mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase.
Die native DNA, der Primer und das DNA-Polymerase-Enzym (Tag-Polymerase) werden in ein PCR-Röhrchen gegeben und die Temperatur in der PCR-Maschine erhöht und abgesenkt, um denaturiert und hybridisiert zu werden.
Schritt 2: Glühen:
Nach der Denaturierung der DNA besteht der nächste Schritt darin, den synthetisierten Primer an die gegenüberliegenden DNA-Stränge der gewünschten Zielsequenz anlagern zu lassen. Ein Tempern (Hybridisierung) kann auftreten, wenn die Temperatur von 95 ° C auf 50/56 ° C abgesenkt wird. Die Temperatur wird dann in der Maschine heruntergefahren.
Sobald die Temperatur abgesenkt wird, binden die nativen DNA-Stränge nicht nur miteinander, sondern auch die Primer. Diese spezifische Hybridisierung oder „Rekombination“ komplementärer Nukleotide bietet sowohl die Grundlage als auch die praktische Grundlage für einen Großteil der rekombinanten DNA (Abb. 48.2).
Schritt 3: Erweiterung der DNA (Taq-Polymerase-Enzym wird benötigt):
Nach dem Annealing der Primer sollten sie mit dem Oligonukleotid-Primer als Startpunkt verlängert werden. beschrieben, dass Enzym DNA-Polymerase für die Synthese von DNA notwendig ist. Daher benötigen wir zur Verlängerung des Primers eine thermostabile DNA-Polymerase, damit das Enzym bei hoher Temperatur nicht zerstört wird.
Die thermostabile Polymerase (Taq-Polymerase) wird aus Thermus aquaticus isoliert. Die Taq-Polymerase hat einen enormen Vorteil bei der Durchführung der PCR-Reaktion. Es hat eine optimale Aktivitätstemperatur von etwa 70 ° C, und nach dem Erwärmen und Abkühlen darf nicht jedes Reagenzglas mit frischem Enzym versetzt werden.
Thermostabile DNA-Polymerase wird jetzt von verschiedenen Unternehmen mit unterschiedlichen Quellen (außer Thermus aquaticus) unter verschiedenen Handelsnamen (TM) hergestellt. Zur Verlängerung des Primers wird die thermostabile DNA-Polymerase in das Röhrchen gegeben und die Temperatur wird dann auf 65 bis 70 ° C erhöht.
Nachfolgende Zyklen der Strangtrennung (Denaturierung), Primer-Hybridisierung (Annealing) und Strangsynthese (Extension) stellen eine exponentielle Amplifikation der Zielsequenzen sicher, indem die amplifizierte Sequenz verwendet wird, wenn der vorherige Zyklus als neue Matrize drei Zyklen aufweist (Abb. 48.2.) ).
Grundierung machen:
Bei den Primern handelt es sich um eine kurze Sequenz (oft RNA), die verwendet wird, um zwei auf Primer bezogene Nukleotide mit einem für jedes Ende des DNA-Fragments herzustellen und stellt ein freies 3-OH-Ende bereit, an dem eine DNA-Polymerase die Synthese einer Desoxyribonukleotidkette startet.
Eine Sequenz wird in der Sense-Richtung gemacht, während die andere in der Antisense-Richtung gemacht wird. (Abb. 48.2). Der Primer wird zur Vorbereitung der Synthese komplementärer DNA-Stränge verwendet und so gestaltet, dass die DNA zwischen den Primern das zu amplifizierende Fragment von Interesse ist.
Wenn die Messenger-RNA (mRNA) amplifiziert wird, muss sie durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die reverse Transkriptase, in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt werden. Der cDNA-Komplex wird dann in doppelsträngige DNA umgewandelt und dient als Vorlage für eine nachfolgende PCR-Reaktion.
Dies wird häufig als umgekehrte Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bezeichnet. Die Primer können künstlich erzeugt oder von den Firmen bezogen werden.
Nach Beendigung der Reaktion können die amplifizierten Produkte (DNA) durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. Die wichtige physikalische Eigenschaft eines DNA-Moleküls besteht darin, dass jedes einzelne Nukleotid eine negative Nettoladung besitzt, die sich aus der Phosphatgruppe ergibt.
Fragmente unterschiedlicher Größe, die einem elektrischen Feld ausgesetzt sind, neigen daher dazu, in Abhängigkeit von der Größe mit unterschiedlicher Geschwindigkeit zur positiven Elektrode zu wandern, wobei kleine Fragmente schneller als die größeren wandern. Dieser Vorgang der Trennung durch elektrische Ladung wird Elektrophorese genannt.
Die DNA-Proben werden, nachdem sie durch ein Restriktionsenzym (Endonuclease) zu Fragmenten unterschiedlicher Größe verdaut worden sind, zu einem Trägermedium wie Agrosegel oder Acrylamid zugegeben. Die Poren des Gels hängen von seinem Prozentsatz ab und können mit einem (molekularen) Sieb verglichen werden. Daher hängt die Migrationsgeschwindigkeit der DNA-Fragmente durch das Gel sowohl von der DNA-Fragmentgröße als auch von der angelegten Spannung ab.
Das Verfahren zum Trennen und Abziehen spezifischer DNA-Fragmente ist Southern Blotting. Die Bedeutung dieser Technik besteht darin, dass Einzelstrangfragmente durch Kapillarwirkung auf ein festes Trägermedium (Nylon- oder Cellulosemembran) übertragen und durch Erhitzen dauerhaft fixiert werden können (Abb. 48.3).
Nach der Elektrophorese kann das DNA-Muster nach Behandlung mit Ethidiumbromid-Färbung unter UV-Lampe sichtbar gemacht werden; Das Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff. Die Agrosegelelektrophorese unterschied Fragmente von 100 Basenpaaren bis 60000 Basenpaaren (60 kb), wohingegen Polyacrylamidgele Fragmente als 1000 Basenpaare (1 kb) effektiv trennen.
Die Impulsgelelektrophorese (PFGE) hat die Trennung von DNA-Fragmenten sogar bis zu 2 kb möglich gemacht. Bei diesem Verfahren wird das elektrische Feld in verschiedene Richtungen verändert, wodurch die DNA-Moleküle gezwungen werden, sich zwischen jedem Impuls oder elektrischen Strom neu zu orientieren. Dies ist die beste Technik, um ein bekanntes Gen zu identifizieren.
Die Endonukleasen können 3, 4, 5, 6 oder 8 Basenpaare erkennen und sind auf dem Markt erhältlich.
PCR-Puffer / Salze.
Für Taq-DNA-Polymerase wird der Puffer wie folgt hergestellt:
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl bei Raumtemperatur
Dimethylsulfoxid (DMSO) und Glykol werden als Colösungsmittel in PCR-Puffern verwendet, wenn das Target eine sehr hohe Denaturierungstemperatur aufweist.
Desoxynukleotidtriphosphat (dNTPs) sind Ionenkofaktoren.
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Das Grundprinzip wird wie folgt beschrieben:
Es gibt vier dNTPs, nämlich dATP (Adenintriphosphat), dCTP (Cytosin), dGTP (Gunin), dUTP (Uracil), die gemäß den Basenpaarregeln verwendet werden, um den Primer zu verlängern und schließlich die Zielsequenz zu kopieren.
Das dNTP bindet mit Mg 2+ . Die Menge der in einer Reaktion vorhandenen dNTPs bestimmt die Menge an freiem Mg 2+, die für eine optimale Enzymaktivität verfügbar ist. Stamm-dNTP-Lösungen sollten mit Tris-Base auf pH 7, 0 neutralisiert und ihre Konzentration spektrophotometrisch bestimmt werden.
Substrat- und Substratanaloga:
Taq-Polymerase arbeitet (dNTP) sehr effektiv. Es gibt jedoch einige modifizierte Substrate anstelle von Tag-DNA-Polymerasesubstrat. Sie sind Dogoxigenin-dNTP, Biotin-11-dUTP, C7-Deaza-dGTP und fluoreszenzmarkiertes dNTPS.
Die folgenden PCR-Typen werden allgemein verwendet:
(1) verschachtelte PCR;
(2) RT-PCR;
(3) Anker-PCR;
(4) asymmetrische PCR;
(5) Inverse PCR;
(6) DOP-PCR.
