Oxidasetest an Bakterien, um herauszufinden, ob sie Gelatine hydrolysieren kann, indem sie Gelatinase produziert

Oxidasetest an Bakterien, um herauszufinden, ob sie Gelatine hydrolysieren kann, indem sie Gelatinase produziert!

Prinzip:

Einige Bakterien haben die Fähigkeit, Gelatine zu hydrolysieren, da sie das proteolytische Enzym "Gelatinase" produzieren können.

Während die Gelatine durch Quecksilberchlorid unter Bildung von Transluzenz ausgefällt wird, werden ihre hydrolysierten Endprodukte nicht durch Quecksilberchlorid ausgefällt, wofür sie keine solche Transluzenz erzeugen, sondern eher Transparenz.

Im Gelatinetest werden die Testbakterien auf Agarplatten gezüchtet, die Gelatine enthalten. Nachdem Kolonien der Bakterien sichtbar sind, werden die Platten mit einer Lösung von Quecksilberchlorid geflutet. Wenn die Bakterien die Fähigkeit haben, Gelatine zu hydrolysieren, hydrolysieren ihre Kolonien die Gelatine im Medium in den sie umgebenden Bereichen, während der Rest der Plattenbereiche nicht hydrolysierte Gelatine enthält.

Als Ergebnis bilden sich beim Fluten mit einer Lösung von Quecksilberchlorid transparente klare Zonen um die Kolonien, da die um sie gebildeten hydrolysierten Produkte keine Ausfällungen mit dem Quecksilberchlorid bilden. Andererseits werden die übrigen Plattenbereiche durchscheinend, da die nicht hydrolysierte Gelatine in diesen Bereichen mit Quecksilberchlorid Ausfällungen bildet.

Erforderliche Materialien:

Petrischalen, Erlenmeyerkolben, Wattestäbchen, Impföse, Autoklav, Bunsenbrenner, Laminar-Flow-Kammer, Entsorgungsgefäß, Inkubator, Fraizer-Gelatineagar, Quecksilberchloridlösung, isolierte Kolonien oder Reinkulturen von Bakterien.

Verfahren:

1. Zwei Petrischalen werden gereinigt, mit Kraftpapier abgedeckt und mit Faden oder Gummiband zusammengebunden (Abbildung 7.20). Dieser Schritt sowie die Sterilisation der Petrischalen in Schritt 6 entfallen, wenn ofensterilisierte Petrischalen direkt verwendet werden

2. Die Bestandteile des Gelatine-Agarmediums von Fraizer (das Gelatine als Hauptkomponente enthält) oder seines gebrauchsfertigen Pulvers, das für 100 ml des Mediums erforderlich ist, werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst .

3. Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und unter Verwendung von 0, 1 N HCl auf 7, 2 eingestellt, wenn weniger oder weniger 0, 1 N NaOH verwendet wird.

4. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen.

5. Der Kolben ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

6. Die zwei Petrischalen und der Erlenmeyerkolben, der Fraizers Gelatine-Agarmedium enthält, werden bei 121 ° C (15 psi Druck) 15 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert.

7. Nach der Sterilisation werden sie aus dem Autoklaven genommen und einige Zeit abkühlen gelassen, ohne dass sich das Medium verfestigt. Die Kühlung des Mediums verhindert die Kondensation und Ansammlung von Wassertropfen in den Platten. Wenn das Medium bereits während der Lagerung hergestellt und verfestigt wurde, muss es durch vorsichtiges Erhitzen verflüssigt werden, bis es vollständig schmilzt.

8. Um Gelatine-Agarplatten herzustellen, bevor das sterilisierte Frazier-Gelatine-Agar-Medium in warmem geschmolzenem Zustand abkühlt und sich verfestigt, wird es aseptisch, vorzugsweise in eine Laminar-Flow-Kammer, in die zwei sterilisierten Petrischalen (jeweils etwa 20 ml) gegossen dass das geschmolzene Medium den Boden der Petrischalen vollständig bedeckt.

Dann werden die Platten mit ihren Deckeln bedeckt und abkühlen gelassen, um das Medium in ihnen zu verfestigen. Wasserdampf, der auf der Innenfläche der Platten und Deckel kondensieren kann, wird verdampft, indem die Platten und Deckel etwa 1 Stunde in einem Inkubator bei 37 ° C in umgekehrter Position gehalten werden.

9. Jede Platte ist an der Unterseite in vier Viertel markiert.

10. Die "Spot-Inokulation" der Testbakterien erfolgt aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, in der Mitte jedes Viertels, indem mit Hilfe einer flammsterilisierten Schleife ein Spot (oder ein kleiner Abstrich) der Bakterien erzeugt wird. Die Schlaufe wird nach jeder Impfung sterilisiert.

11. Die inokulierten Platten werden 24 bis 48 Stunden lang in umgekehrter Position bei 37 ° C in einem Inkubator inkubiert, bis Kolonien der Bakterien sichtbar sind.

12. Die Platten werden mit einer Lösung von Quecksilberchlorid (HgCl 2 ) geflutet.

Beobachtungen:

Transparente klare Zonen um Bakterienkolonien gebildet: Gelatinase-positiv.

Transparente klare Zonen, die sich nicht um Bakterienkolonien bilden: Gelatinase-negativ.