Neutrophilenfunktionstests
Neutrophilenfunktionstests!
1. Die Chemotaxis von Neutrophilen kann mit folgenden Methoden bewertet werden:
ein. Modifizierter Boyden-Kammer-Assay:
Die Boyden-Kammer besteht aus einer oberen und einer unteren Kammer, die durch einen Filter mit geringer Porengröße getrennt sind.
Die Neutrophilensuspension wird in die obere Kammer gegeben und eine chemotaktische Substanz wird in die untere Kammer gegeben. Das Ausmaß der Neutrophilenwanderung wird durch Zählen der Anzahl der im Filter eingeschlossenen Neutrophilen und der Anzahl der Neutrophilen in der unteren Kammer mittels Durchflusszytometrie ermittelt.
b. Wells werden in einem halbfesten Agar ausgestanzt:
Eine neutrophile Suspension, eine chemotaktische Substanz und eine nicht-chemotaktische Substanz werden in verschiedene Vertiefungen gegeben. Die Migration von Zellen durch den halbfesten Agar in Richtung der die chemotaktische Substanz enthaltenden Vertiefung wird mikroskopisch bestimmt. Die Migration in Richtung der nicht chemotaktischen Substanz repräsentiert gut die zufällige Bewegung von Zellen (bekannt als Chemokinese).
2. Neutrophile Phagozytose:
Eine Vielzahl von Partikeln kann verwendet werden, um die Phagozytenkapazität der Neutrophilen zu bestimmen. Die Partikel werden mit Neutrophilen inkubiert und später mikroskopisch auf die Anwesenheit der Partikel in den Neutrophilen beobachtet. Die Zelloberflächengebundenen Partikel werden durch Säurebehandlung entfernt, so dass die Zelloberflächengebundenen Partikel nicht als intrazelluläre Partikel gezählt werden.
Jetzt sind auch fluoreszenzmarkierte oder radioaktive Partikel verfügbar, die eine direkte Zählung der Partikel durch Phagozyten ermöglichen.
3. Bestimmung des Atmungsbursts und der Degranulation:
Die chronische granulomatöse Erkrankung (CGD) ist eine Immunschwächekrankheit, bei der die intrazelluläre Abtötung durch Phagozyten aufgrund der Unfähigkeit der Phagozytenzellen, ein Superoxidanion (O 2 - ) zu erzeugen, beeinflusst wird.
ein. Nitroblauetetrazolium (NBT) -Dia-Test:
NBT ist ein klarer, gelber, wasserlöslicher Farbstoff. NBT wird durch O 2 - zu einem tiefblauen Formazon reduziert. Die Neutrophilen werden durch Behandlung mit PMA oder durch Einwirkung von LPS aktiviert. Die aktivierten Neutrophilen werden dann mit NBT inkubiert. Wenn die Neutrophilen O 2 - produzieren, wird der NBT zu tiefblauem Formazon reduziert und unter dem Mikroskop sichtbar gemacht. Ein quantitativer Test kann durchgeführt werden, indem das Formazon aus den Neutrophilen extrahiert wird und das Formazon mit einem Spektrophotometer getestet wird. Kinder mit vollständigem Mangel an NADPH-Oxidaseaktivität zeigen einen groben Mangel im NBT-Test. Kinder mit partiellem Verlust der NADPH-Oxidase-Aktivität lassen sich jedoch besser durch quantitative Tests nachweisen.
b. Durchflusszytometrieassay mit 2'7'-Dichlorfluorescein (DCF):
Das während der NADPH-Oxidaseaktivität gebildete O 2 - wird durch das Enzym Superoxiddismutase in H 2 O 2 umgewandelt. H 2 O 2 ist eine weitere mikrobizide Chemikalie. H 2 O 2 oxidiert die nicht fluoreszierende Verbindung DCF zu einer fluoreszierenden Verbindung, die vom Durchflusszytometer nachgewiesen wird.
Phagozyten werden mit DCF inkubiert und DCF dringt in die Zellen ein.
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Dann werden die Neutrophilen durch PMA oder andere Mittel aktiviert.
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Anschließend werden die Zellen im Durchflusszytometer analysiert. Es wird eine Zunahme der Fluoreszenz der Phagozyten festgestellt.
Das Durchflusszytometer ermöglicht auch die quantitative Bestimmung von H 2 O 2, das von einzelnen Zellen produziert wird. Daher ist die durchflusszytometrische Analyse beim Nachweis von Teildefekten in der NADPH-Oxidasefunktion oder beim Screening auf heterozygote Träger der X-verknüpften Form von CGD nützlich.
4. Phagozyten-Degranulation:
Phagozytäre Degranulation ist ein Prozess der Fusion von Lysosomen mit Phagosomen, der zur Abgabe von lysosomalen Inhalten in das Phagolysosom führt. Die Degranulation ist ein aktiver Prozess und erfordert Energie. Die Beeinträchtigung der normalen Stoffwechselwege von Neutrophilen (insbesondere der Sauerstoffverbrauch und der Fleischstoffwechsel von Glukose durch den Hexosemonophosphat-Shunt) beeinträchtigt die Degranulation. Folglich ist die intrazelluläre Abtötung von Mikroben durch die Phagozyten betroffen.
Die Degranulation von Phagozyten in einer Suspension kann durch verschiedene Aktivierungsmittel und Verbindungen induziert werden, die das Cytoskelett der Zelle beeinflussen (wie Cytochalasin B). Die Phagozyten setzen hauptsächlich das sekundäre und das tertiäre Granulat frei und werden mittels ELISA-Methoden gemessen.
ich. Lactoferrin (ein sekundäres neutrophiles Granulat) wird als Marker für die Freisetzung sekundärer Granulate verwendet.
ii. Albumin wird als Maß für die Freisetzung von tertiärem Granulat getestet.
Der Test für die Freisetzung von Primärgranulat aus Phagozyten wird durchgeführt, indem nach Freisetzung von Primärgranulat in geschlossenen Räumen gesucht wird. Bei der „frustrierten Phagozytose“ handelt es sich um einen Assay zur Beurteilung der Freisetzung von Primärgranula (Abb. 27.7).
Durch Wärme aggregierte Immunglobuline oder Immunkomplexe werden an eine Petrischale gebunden.
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Neutrophile werden zu den Petrischalen hinzugefügt und inkubiert. Durch ihre Fc-Rezeptoren binden die Neutrophilen an die Fc-Regionen von hitzeaggregiertem Immunglobulin oder Immunkomplexen. Folglich versuchen die Neutrophilen, die durch Wärme aggregierten Immunglobuline oder Immunkomplexe phagozytieren. Die Neutrophilen können sie jedoch nicht phagozytieren (weil sie an der Petrischale befestigt sind). Folglich setzen die Neutrophilen ihren körnigen Inhalt über sich frei.
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Die Freisetzungsrate von Primärgranulat-Proteinen, wie Myeloperoxidase oder β-Glucoronidase, wird zur Abschätzung der Degranulation verwendet. Defizite bei der Synthese von primären / sekundären Granulaten können auch durch Anfärben intrazellulärer Granulate mit markierten mAbs und Durchflusszytometrie nachgewiesen werden.
Bakterielle Abtötung durch Neutrophile:
Mikrobizide Assays sind schwer durchzuführen. Im Allgemeinen werden mikrobizide Assays durchgeführt, wenn einfachere Assays keine ausreichenden Informationen liefern.
Der Staphylococcus aureus-Stamm 502A wird üblicherweise verwendet, um die mikrobizide Kapazität der Neutrophilen zu bestimmen.
Der in der log-Phase wachsende Staphylococcus aureus-Stamm 502A wird mit humanen Seren inkubiert (um Immunglobulin- und Komplementproteine als Opsonine bereitzustellen).
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Frisch isolierte Neutrophile werden in einer Konzentration von 5-10 Bakterien / Neutrophilen zugesetzt.
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Nach 30 Minuten Inkubation werden die Bakterien, die nicht von den Neutrophilen verschlungen werden, durch die Zugabe des Medikaments Gentamicin abgetötet. (Gentamidn dringt nicht in Neutrophile ein und daher bleiben phagozytierte Bakterien am Leben.)
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Aliquots von Neutrophilen werden in Abständen von 30 Minuten entfernt und mit sterilem destilliertem Wasser gemischt, um die Neutrophilen zu lysieren und die Bakterien freizusetzen. Die Anzahl der lebensfähigen Bakterien in jedem Aliquot wird durch serielle Verdünnung und Plattierung auf Blutagarplatten gemessen.
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Die Ergebnisse werden in einer Grafik dargestellt.
ich. Normale Neutrophile zeigen nach einer einstündigen Inkubation eine Reduktion der lebenden intrazellulären Bakterien um zwei log.
ii. Es gibt praktisch keine Tötung durch die Neutrophilen von homozygoten CCD-Patienten.
iii. Neutrophile aus heterozygoten CGD-Trägern zeigen eine teilweise Abtötung durch die Neutrophilen.
