Experiment zum Isolieren von Kolophagen eines Virus (mit Diagramm)

Experimentieren Sie, um Coliphage eines Virus zu isolieren!

Prinzip:

Der Bakteriophage oder Phage (Virus), der die Bakterien, Escherichia coli, befällt, wird Coliphage (Coli: E. coli, Phage: Bakteriophage) genannt.

Es kann aus verschiedenen natürlichen Quellen wie Boden, Fäkalien und rohem Abwasser gewonnen werden. Die Isolierung von diesen Quellen ist nicht sehr einfach, da es in geringer Konzentration vorliegt.

Daher wird zunächst die Anzahl durch einen Anreicherungsschritt erhöht, bei dem eine reiche Kultur der Wirtsbakterien (dh E. coli) zu der coliphagehaltigen Probe hinzugefügt und inkubiert wird. Der Coliphage infiziert E. coli und nimmt stark zu. Diese koliphagenreiche Kultur wird zentrifugiert, um die Partikelstoffe abzusetzen.

Das Sediment wird verworfen und der Überstand wird durch einen Mikrobenfilter gefiltert, um Bakterien und andere Partikel zurückzuhalten, während der Kolipage durchgelassen werden kann. Das an Coliphage reiche Filtrat wird zum Keimen einer Suspension von E. coli verwendet, die dann als konfluenter Rasen auf einer Agarplatte wachsen kann.

Der Coliphagen wächst innerhalb der E. coli-Zellen und lysiert sie. Die Lyse der Bakterienzellen führt zur Bildung klarer Zonen auf dem zusammenfließenden Rasen von Bakterien. Diese klaren Zonen werden Plaques genannt. Es wird angenommen, dass jede klare Zone von einem einzelnen Coliphagen gebildet wird.

Erforderliche Materialien:

Pipetten, Erlenmeyerkolben, Petrischalen, Reagenzgläser, Wattestäbchen, Bunsenbrenner, Entsorgungsgefäß, Zentrifuge, Membranfiltrationsapparat, Laminar-Flow-Kammer, Autoklav, Inkubator, Bakteriophagenbouillon, Trypton-Weichagar, Trypton-Hartagar, Nährbouillonkultur Bakterien Escherichia coli (z. B. E. coli B), Probe (z. B. Rohabwasser).

Verfahren:

1. Fünf Pipetten (in einem Edelstahlpipettengehäuse) und fünf Petrischalen werden in einem Heißluftofen bei 180 ° C für 3 Stunden sterilisiert. Alternativ können sie mit Kraftpapier abgedeckt, mit Faden oder Gummiband zusammengebunden und zusammen mit den Medien im Autoklaven sterilisiert werden (Abbildung 8.5).

2. Die für 100 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile des Bakteriophagenbrühenmediums oder seines Fertigpulvers werden abgewogen, in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250 ml Erlenmeyerkolben gelöst und der pH-Wert auf 7, 6 eingestellt. Der Kolben ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

3. Die für 100 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile des Trypton-Weichagarmediums oder seines gebrauchsfertigen Pulvers werden abgewogen, in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 7, 5 eingestellt.

4. Dieses flüssige Medium wird in 5 Reagenzgläser (je 2 ml) verteilt, die mit Baumwolle verstopft sind, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

5. Die für 100 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile von Trypton-Hartagarmedium oder dessen gebrauchsfertiges Pulver werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Erwärmen nach pH-Einstellung auf 7, 5 gelöst. Der Kolben ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

6. Der Kolben, der die Bakteriophagenbrühe enthielt, die 5 Trypton-Weichagar-Röhrchen, der Kolben, der Trypton-Hartagarmedium enthielt, und ein leerer, mit Baumwolle verschlossener 250-ml-Erlenmeyerkolben wurden bei 121ºC (15 psi Druck) 15 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert.

7. Das sterilisierte Trypton-Hartagarmedium im Erlenmeyerkolben wird aseptisch in die 5 sterilisierten Petrischalen gegossen und abkühlen gelassen, um 5 Trypton-Hartagarplatten zu erhalten.

8. In den mit Baumwolle verschlossenen, sterilisierten leeren 250 ml-Erlenmeyerkolben werden 5 ml sterilisierte Bakteriophagenbouillon, 5 ml E. coli B-Bouillonkultur und 45 ml Rohabwasser aseptisch überführt, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer (Abbildung 8.6). .

9. Der Kolben wird 24 Stunden bei 37 ° C inkubiert, um zu ermöglichen, dass sich der Coliphagen im Abwasser innerhalb der Wirtsbakterienzellen (Zellen von E. coli B) vermehrt.

10. Der Kolbeninhalt wird in 100 ml-Zentrifugenröhrchen gegossen und 20 Minuten bei 2500 U / min in einer Zentrifuge zentrifugiert, um die Partikel abzusetzen. Das Sediment wird verworfen.

11. Der koliphagenreiche Überstand wird durch eine Membranfiltrationsvorrichtung filtriert. Der Rückstand wird verworfen.

12. Die fünf sterilisierten Trypton-Weichagar-Röhrchen werden genommen und in einem Wasserbad auf 100 ° C erhitzt, um den Agar zu schmelzen. Die Röhrchen werden gekühlt und auf einem Wasserbad bei 45 ° C gehalten.

13. Mit einer sterilen Pipette werden 1, 2, 3, 4 und 5 Tropfen des coliphagehaltigen bakterienfreien Filtrats aseptisch in die fünf Trypton-Weichagar-Röhrchen überführt.

14. In jedes Trypton-Weichagar-Röhrchen werden 0, 1 ml einer Nährbouillonkultur von Escherichia coli B aseptisch transferiert.

15. Der Inhalt der fünf Trypton-Weichagar-Röhrchen mit dem Virus, Coliphage und den Bakterien, E. coli B, wird durch Rotation der Röhrchen zwischen den Handflächen schnell gemischt.

16. Der Inhalt wird über die fünf Trypton-Hartagarplatten (gekennzeichnet mit 1 bis 5 Tropfen) gegossen, wodurch eine Doppelschicht-Plattenkulturzubereitung gebildet wird. Die Platten werden sanft gewirbelt und aushärten gelassen.

17. Die beimpften Platten werden 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 ° C in einer umgekehrten Position inkubiert.

Beobachtungen:

1. Alle Platten werden für Plaque bildende Einheiten (PFUs) beobachtet, die sich als klare Zonen auf dem Rasen von Bakterien entwickeln. Die Plaquebildung weist auf das Vorhandensein von Coliphagen in der Kultur hin.

2. Jede Platte zeigt ein reiches Wachstum von isoliertem Coliphagen.

3. Die Anzahl der Plaques wird in allen Platten gezählt und wie folgt tabelliert (Tabelle 8.1).

Tabelle 8.1: Beobachtungen der Anzahl der Coliphagen :

Anzahl der Tropfen

Anzahl der Plaketten

1 Tropfen

2 Tropfen

3 Tropfen

4 Tropfen

5 Tropfen