Im Dole-Test die Fähigkeit der Bakterien herauszufinden, die Aminosäure Tryptophan zu hydrolysieren (mit Abbildung)

Im Dole-Test können Sie herausfinden, ob Bakterien die Aminosäure Tryptophan hydrolysieren können!

Prinzip:

Einige Bakterien haben die Fähigkeit, die Aminosäure Tryptophan zu Indol zu hydrolysieren, da sie das Enzym Tryptophanase produzieren können.

Tryptophan wird unter Bildung von Indol, Brenztraubensäure und Ammoniak hydrolysiert. Indol wird durch das Farbreagenz Paradimethylaminobenzaldehyd (p-DMAB, dh Kovacs Reagenz) nachgewiesen, das einen rosa Ring bildet. Indol reagiert mit p-DMAB unter Bildung der Verbindung "Quinoid-Rotviolett-Verbindung (Rosindolfarbstoff)", die rosa ist. Der Ring entsteht an der Oberfläche, wenn das Reagenz in Amylalkohol hergestellt wird.

Im Indol-Test werden die Testbakterien in einer Nährlösung gezüchtet, die Tryptophan enthält. Wenn die Bakterien die Fähigkeit haben, Tryptophan zu Indol zu hydrolysieren, wird nach Zugabe von p-DMAB ein rosafarbener Ring an der Oberfläche der Kulturflüssigkeit gebildet.

Erforderliche Materialien:

Reagenzgläser, Erlenmeyerkolben, Wattestopfen, Impföse, Autoklav, Bunsenbrenner, Laminar-Flow-Kammer, Entsorgungsglas, Inkubator, Trypton-Bouillon, Kovac-Reagenz (Paradimethylaminobenzaldehyd), isolierte Kolonien oder Reinkulturen von Bakterien.

Verfahren:

1. Die für 100 ml der Bouillon benötigten Bestandteile von Trypton-Nährmedium oder dessen gebrauchsfertiges Pulver werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst. Tryptone dient als Quelle für Tryptophan. Daher ist die Zugabe von Tryptophan zur Brühe optional (Abbildung 7.3).

2. Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und mit 0, 1 N HCl auf 0, 1 eingestellt, wenn 0, 1 N NaOH verwendet wird, oder mit 0, 1 N NaOH, wenn es weniger ist. Der Kolben wird gegebenenfalls erhitzt, um die Bestandteile vollständig aufzulösen.

3. Die Brühe wird in fünf Reagenzgläser (je ca. 5 ml) verteilt, mit Watte verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband zusammengebunden.

4. Die Bouillonröhrchen werden 15 Minuten bei 121 ° C (15 psi Druck) in einem Autoklaven sterilisiert.

5. Man lässt die Bouillonröhrchen auf Raumtemperatur abkühlen.

6. Die Testbakterien werden aseptisch, vorzugsweise in einer Kammer mit laminarer Strömung, mit Hilfe einer über Bunsenflamme sterilisierten Impföse in die Brühe geimpft. Die Schlaufe wird nach jeder Impfung sterilisiert.

7. Die inokulierten Bouillonröhrchen werden 48 Stunden in einem Inkubator bei 37 ° C inkubiert.

8. Das Farbreagenz, para-Dimethylaminobenzaldehyd (p-DMAB) (dh Kovacs Reagenz), wird in die Bouillonröhrchen (jeweils 0, 5 ml) getropft und nach 1 Minute beobachtet.

Alternative:

7. Mit Oxalsäure getränkte Papierstreifen werden an die Mündung der inokulierten Bouillonröhrchen gelegt, so dass etwa die Hälfte der Papierstreifen in den Tuben verbleibt, ohne die Bouillon zu berühren, und die andere Hälfte bleibt nach außen. Dazu wird Filterpapier in etwa 35 mm lange und 5 mm breite Streifen geschnitten. Die Streifen werden in heiße gesättigte wässrige Oxalsäurelösung getränkt und vor der Verwendung getrocknet.

8. Die inokulierten Bouillonröhrchen werden 48 Stunden in einem Inkubator bei 37 ° C inkubiert.