DNA-Replikation: Mechanismen der DNA-Replikation

Einige der wichtigsten Arten der DNA-Replikation sind wie folgt!

Die DNA-Replikation in Eukaryonten ist semikonservativ, semi-diskontinuierlich und bidirektional im Vergleich zu semikonservativ, bidirektional und kontinuierlich bei Prokaryonten.

Bild mit freundlicher Genehmigung: dbriers.com/tutorials/wp-content/uploads/2012/12/DNA_replication_split.png

Die DNA-Replikation erfolgt während der S-Phase des Zellzyklus. Es ist ein mehrstufiger komplexer Prozess, der über ein Dutzend Enzyme und Proteinfaktoren erfordert. Es beginnt an einer bestimmten Stelle, die als Replikationsursprung oder ori bezeichnet wird. Bakterielle und virale DNA hat einen einzelnen Replikationsursprung. Es fungiert als einzelne Repliziereinheit oder Replikon.

In eukaryotischer DNA gibt es eine Reihe von Replikationsursprüngen. Es hat mehrere replizierende Segmente oder Replikons, dh Multireplikons. Ohne ori erfolgt keine Replikation. Das Erfordernis eines Vektors für die rekombinante DNA-Technologie besteht darin, den Replikationsursprung zu erhalten.

Die Replikation von DNA ist energetisch sehr teuer. Das Hauptenzym der DNA-Replikation ist DNA-abhängige DNA-Polymerase. Die DNA-Replikation ist ziemlich schnell. Die Replikation von DNA von E. coli mit 4, 6 × 10 ⁶ bp dauert 19 Minuten.

Die durchschnittliche Polymerisationsrate der Basen beträgt in jeder Richtung 2000 bp pro Sekunde. Die Replikation erfordert reichlich Energie, die durch den Abbau von Triphosphaten von Desoxyribonukleotiden entsteht.

Die Replikation erfolgt wie folgt:

1. Aktivierung von Desoxyribonukleotiden:

Desoxyribonukleotide oder Desoxyribonukleosidmonophosphate treten frei im Nukleoplasma auf. Es gibt vier Typen: DeAMP (Desoxyadenosinmonophosphat), DeGMP (Desoxyguanosinmonophosphat), DeCMP (Desoxycytidinmonophosphat) und DeTMP (Desoxythymidinmonophosphat). Sie werden zuerst phosphoryliert und in aktive Formen umgewandelt, die drei Phosphatreste anstelle von einem haben. Enzyme Phosphorylase wird zusammen mit Energie benötigt.

Die phosphorylierten Nukleotide sind DeATP (Desoxyadenosintriphosphat), DeGTP (Desoxyguanosintriphosphat), DeCTP (Desoxycytidintriphosphat) und DeTTP (Desoxythymidintriphosphat). Diese Triphosphate von Basen dienen einem doppelten Zweck. Sie wirken als Substrat und liefern Energie für die Polymerisation von Nukleotiden.

2. Exposition von DNA-Strängen:

Die Enzym-Helikase (Unwindase) wirkt auf die Ori-Stelle und öffnet die beiden DNA-Stränge durch Abspalten von Wasserstoffbrücken. Die getrennten Stränge werden mittels einzelsträngiger Bindungsproteine ​​(SS BPs) oder helixstabilisierender Proteine ​​stabilisiert. Das Abwickeln erzeugt Spannung im abgewickelten Teil, indem mehr Supercoils gebildet werden. Spannung wird durch Enzyme Topoisomerasen freigesetzt.

Sie bewirken, dass der DNA-Strang gekerbt und wieder verschlossen wird. Neben der Topoisomerase besitzen Bakterien ein anderes Enzym namens DNA-Gyrase, das negative Supercoils einführen kann (ältere Arbeiter glaubten, dass Gyrase sowohl für Helikase als auch für Topoisomerase funktionierte).

Mit Hilfe verschiedener Enzyme werden beide DNA-Stränge für die Replikation geöffnet. Aufgrund eines sehr hohen Energiebedarfs öffnet sich jedoch nicht die gesamte DNA in einem Abschnitt. Der Trennungspunkt verläuft langsam in beide Richtungen. In jeder Richtung gibt es das Aussehen einer Y-förmigen Struktur, die als Replikationsgabel bezeichnet wird (Abb. 6.13 und 6.14).

3. RNA-Primer:

Es ist wichtig für die Initiierung neuer DNA-Ketten. RNA-Primer ist ein kleiner RNA-Strang, der am 5'-Ende eines neuen DNA-Strangs mit Hilfe eines DNA-spezifischen RNA-Polymerase-Enzyms (Primase) synthetisiert wird. RNA-Primer wird am freien Ende eines Strangs und am Gabelende des anderen Strangs gebildet. Die Bildung eines RNA-Primers bildet die Startphase der DNA-Synthese, da DNA-Polymerasen ohne das Vorhandensein eines RNA-Primers keine Nukleotide addieren können.

Ein komplexeres Enzym, das als Primo Some bezeichnet wird, ist in Phagen × 174 und einigen anderen prokaryotischen Systemen erforderlich. In Eukaryonten wird die Funktion der Primase durch das Enzym DNA-Polymerase α ausgeführt. Es baut ~ 10 Basen-RNA und 20-30 Basen DNA auf (Lewin, 2004). Nach dem Start der Nukleotidkette wird der RNA-Primer entfernt und die Lücke wird mit DNA-Polymerase I in Prokaryoten und DNA-Polymerase β in Eukaryoten gefüllt.

4. DNA-Polymerasen:

Prokaryoten haben drei Haupttypen von DNA-synthetisierenden Enzymen, die als DNA-Polymerasen III, II und I bezeichnet werden. Alle addieren Nukleotide in 5 '-> 3'-Richtung auf einem 3' -> 5'-Strang des Elternstrangs. Sie besitzen auch 3 '-> 5'-Exonukleaseaktivität. Während die DNA-Polymerase III hauptsächlich an der DNA-Replikation beteiligt ist (Addition und Polymerisation neuer Basen), ist Polymerase I das Hauptreparaturenzym. Polymerase II ist ein kleines Reparaturenzym.

DNA-Polymerase I hat auch 5 -> 3 Exonuklease-Aktivität. In Eukaryoten werden fünf Arten von DNA-Polymerasen gefunden - α, β, γ, δ und ε, aber die drei Hauptgruppen sind α, δ und e. Polymerase 8 ist an der Replikation des Leitstrangs beteiligt. Polymerase kann zusammen mit anderen Rollen bei der Synthese von verzögerndem Strang helfen. Polymerase & agr; ist das größte und hauptsächliche Enzym der DNA-Replikation. Alle DNA-Polymerasen haben die Konfiguration einer greifenden Hand mit Daumen auf einer Seite, Fingern auf der anderen und der handflächenartigen konkaven katalytischen Stelle zum Kombinieren von Templat- und Basenpaaren.

5. Basenpaarung:

Die zwei getrennten DNA-Stränge in der Replikationsgabel fungieren als Schablonen. Desoxyribonukleosidtriphosphate liegen gegenüber den Stickstoffbasen exponierter DNA-Matrizen - deTTP gegenüber A, deCTP gegenüber G, deATP gegenüber T und deGTP gegenüber C.

Der nucleophile Angriff trennt ein Pyrophosphat (PPi) vom Triphosphat. Phosphodiesterbindungen werden hergestellt. Die Hydrolyse von Pyrophosphat durch das Enzym Pyrophosphatase setzt Energie frei. Desoxyribouncleosidtriphosphat → Desoxyribouncleosidmonophosphat + PPi

Die Energie wird zur Herstellung von Wasserstoffbrücken zwischen den freien Nukleotiden und Stickstoffbasen von Templaten verwendet.

6. Kettenbildung:

Es erfordert DNA-Polymerase III (Kornberg, 1956) in Prokaryoten und Polymerase δ / ε in Eukaryoten. DNA-Polymerase III ist ein komplexes Enzym mit sieben Untereinheiten (a, β, ƍ, ƴ, €, θ, τ). In Gegenwart von Mg ²⁺, ATP (GTP), TPP und DNA-Polymerase III bilden die benachbarten Nukleotide, die an Stickstoffbasen jedes Matrizen-DNA-Strangs gebunden sind, Phosphodiester-Bindungen und werden zur Bildung eines replizierten DNA-Strangs verknüpft.

Wenn die Replikation fortschreitet, werden neue Bereiche der Stamm-DNA-Duplex abgewickelt und getrennt, so dass die Replikation vom Ursprungsort zum anderen Ende hin schnell abläuft. Der RNA-Primer wird entfernt und die Lücke mit komplementären Nukleotiden mittels DNA-Polymerase I gefüllt. Aufgrund der sequentiellen Öffnung der DNA-Doppelkette und ihrer Replikation zur Bildung von zwei Ketten wird DNA-Replikation auch als Zipper-Duplikation bezeichnet.

DNA-Polymerase kann jedoch Nucleotide nur in 5 '→ 3'-Richtung auf einem 3' -> 5'-Strang polymerisieren, da sie diese am 3'-Ende hinzufügt. Da die beiden DNA-Stränge in antiparallelen Richtungen verlaufen, bieten die beiden Schablonen unterschiedliche Enden für die Replikation. Die Replikation über die beiden Schablonen verläuft somit in entgegengesetzte Richtungen. Ein Strang mit Polarität У -> 5 'bildet seinen komplementären Strang fortlaufend, da dessen 3'-Ende immer zur Verlängerung geöffnet ist.

Man nennt es Leitstrang. Die Replikation ist auf dem anderen Templat mit der Polarität 5 '→ 3 diskontinuierlich, da nur ein kurzes Segment des DNA-Strangs in 5' → 3-Richtung aufgebaut werden kann, wenn nur ein kleines Templatstück auf einmal belichtet wird. Kurze Segmente der replizierten DNA werden Okazaki-Fragmente genannt (= Okasaki-Segmente; Reiji Okazaki, 1968). Jeder von ihnen hat 1000 - 2000 bp in Prokaryoten und 100-200 bp in Eukaryoten.

Ein RNA-Primer ist auch erforderlich, wenn ein neues Okazaki-Fragment erstellt wird. Nach dem Ersetzen des RNA-Primers durch Desoxyribonukleotide und ihrer Polymerisation werden Okazaki-Fragmente mittels eines Enzyms, DNA-Ligase, miteinander verbunden (Khorana, 1967). Der aus Okazaki-Fragmenten aufgebaute DNA-Strang wird als verzögerter Strang bezeichnet.

Da ein Strang kontinuierlich wächst, während der andere Strang diskontinuierlich gebildet wird, ist die DNA-Replikation semi-diskontinuierlich. Da die Replikation bidirektional vom Replikationsursprung oder ori ausgeht, wird ein Elternstrang auf der einen Seite einen Leitstrang und auf der anderen Seite einen verzögernden Strang bilden. Das Umgekehrte tritt bei den übergeordneten Strängen der anderen Seite auf. Dies hilft beim gleichzeitigen Abschluss der Replikation im gesamten Replikon.

7. Korrekturlesen und DNA-Reparatur:

Bei der Replikation wird manchmal eine falsche Basis eingeführt. Die Frequenz ist eins zu zehntausend. Die DNA-Polymerase III kann dasselbe spüren. Es geht zurück, entfernt die falsche Basis, erlaubt das Hinzufügen einer richtigen Basis und geht dann vorwärts. Aber auch die DNA-Polymerase III kann Uracil nicht von Thymin unterscheiden, so dass es häufig anstelle von Thymin eingebaut wird. Eine solche Fehlanpassung wird durch eine Reihe von Enzymen korrigiert.

Es gibt einen separaten Reparaturmechanismus für alle Schäden an der DNA, die durch Mutation, UV-Exposition oder Fehlanpassung verursacht wurden und dem Korrekturlesemechanismus entgehen. Ein Kerb oder Bruch wird durch eine Endonuklease in der Nähe der Reparaturregion verursacht. DNA-Polymerase I (Komberg, 1969) entfernt die fehlangepassten oder falschen Nukleotide, falls vorhanden, und synthetisiert einen korrekten Ersatz, indem der intakte Strang als Matrize verwendet wird. Das neu gebildete Segment wird durch DNA-Ligase versiegelt.