Desoxyribonuclease-Test an Bakterien, um herauszufinden, wie sie DNA hydrolysieren kann (mit Abbildung)

Desoxyribonuclease-Test (DNase-Test) auf Bakterien, um ihre Fähigkeit zur DNA-Hydrolyse (mit Abbildung) herauszufinden!

Prinzip:

Einige Bakterien haben die Fähigkeit, Desoxyribonukleinsäure (DNA) zu Oligonukleotiden zu hydrolysieren, da sie das extrazelluläre hydrolytische Enzym "Desoxyribonuclease" (DNase) produzieren können.

Während die DNA durch Salzsäure ausgefällt wird, wodurch eine Opazität entsteht, werden ihre hydrolysierten Endprodukte, Oligonukleotide, nicht durch Salzsäure ausgefällt, für die sie keine solche Opazität erzeugen; erzeugen Sie eher Transparenz.

Im DNase-Test werden die Testbakterien auf Agarplatten gezüchtet, die DNA enthalten. Nachdem Kolonien der Bakterien sichtbar sind, werden die Platten mit Salzsäure geflutet. Wenn die Bakterien die Fähigkeit haben, DNA zu hydrolysieren, hydrolysieren ihre Kolonien die DNA in dem Medium in den sie umgebenden Bereichen, während die übrigen Plattenbereiche nicht hydrolysierte DNA enthalten.

Als Ergebnis bilden sich beim Fluten mit Salzsäure transparente klare Zonen um die Kolonien, da die um diese gebildeten hydrolysierten Produkte, Oligonukleotide, keine Ausfällungen mit der Salzsäure bilden.

Auf der anderen Seite werden die übrigen Plattenbereiche undurchsichtig, da die nicht hydrolysierte DNA in diesen Bereichen mit der Salzsäure ausfällt. Wenn Toluidinblau anstelle von Salzsäure verwendet wird, entsteht nur um die Kolonien ein rosafarbener Halo.

Erforderliche Materialien:

Petrischalen, Erlenmeyerkolben, Wattestäbchen, Impföse, Autoklav, Bunsenbrenner, Laminar-Flow-Kammer, Entsorgungsgefäß, Inkubator, DNase-Agar, IN-Salzsäure (oder 0, 1% Toluidinblau), isolierte Kolonien oder Reinkulturen von Bakterien.

Verfahren:

1. Zwei Petrischalen werden gereinigt, mit Kraftpapier abgedeckt und mit Faden oder Gummiband zusammengebunden (Abbildung 7.23). Dieser Schritt sowie die Sterilisation der Petrischalen in Schritt 6 entfallen, wenn ofensterilisierte Petrischalen direkt verwendet werden.

2. Die Bestandteile des DNase-Agarmediums (enthaltend DNA als Hauptkomponente) oder des für 100 ml des Mediums erforderlichen Fertigpulvers werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst.

3. Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und unter Verwendung von 0, 1 N HCl auf 7, 2 eingestellt, wenn weniger oder weniger 0, 1 N NaOH verwendet wird.

4. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen.

5. Der Kolben ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

6. Die zwei Petrischalen und der konische Kolben, der DNase-Agarmedium enthält, werden bei 121 ° C (15 psi Druck) 15 Minuten lang in einem Autoklaven sterilisiert.

7. Nach der Sterilisation werden sie aus dem Autoklaven genommen und einige Zeit abkühlen gelassen, ohne dass sich das Medium verfestigt. Die Kühlung des Mediums verhindert die Kondensation und Ansammlung von Wassertropfen in den Platten. Wenn das Medium bereits während der Lagerung hergestellt und verfestigt wurde, muss es durch vorsichtiges Erhitzen verflüssigt werden, bis es vollständig schmilzt.

8. Um DNase-Agarplatten herzustellen, bevor das sterilisierte DNase-Agarmedium sich abkühlt und verfestigt, wird es in warmem geschmolzenem Zustand aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, in die zwei sterilisierten Petrischalen (jeweils etwa 20 ml) gegossen Das geschmolzene Medium bedeckt den Boden der Petrischalen vollständig.

Dann werden die Platten mit ihren Deckeln bedeckt und abkühlen gelassen, um das Medium in ihnen zu verfestigen. Wasserdampf, der an der Innenfläche der Platten und Deckel kondensieren kann, wird verdampft, indem die Platten und Deckel etwa 1 Stunde lang in einem Inkubator bei 37 ° C in umgekehrter Position gehalten werden.

9. Jede Platte ist an der Unterseite in vier Viertel markiert.

10. Die "Spot-Inokulation" der Testbakterien erfolgt aseptisch, vorzugsweise in einer Laminar-Flow-Kammer, in der Mitte jedes Viertels, indem mit Hilfe einer flammsterilisierten Schleife ein Spot (oder ein kleiner Abstrich) der Bakterien erzeugt wird. Die Schlaufe wird nach jeder Impfung sterilisiert.

11. Die inokulierten Platten werden 24 bis 48 Stunden lang in umgekehrter Position bei 37 ° C in einem Inkubator inkubiert, bis Kolonien der Bakterien sichtbar sind.

12. Die Platten werden mit einer Lösung von 1 N Salzsäure (oder 0, 1% Toluidinblau) geflutet.

Beobachtungen:

1. Transparente, klare Zonen (oder rosa Halo) um Kolonien gebildet: DNase-positiv.

2. Transparente klare Zonen (oder rosa Halo), die sich nicht um Kolonien herum bilden: DNase-negativ.