Kultivierung von Bakterien aus festen, flüssigen und Wattestäbchen (mit Abbildung)
Zweck:
Die Hauptziele der Kultivierung von Bakterien sind folgende:
1. Erhöhung der Anzahl von Bakterien, um sie in sichtbaren Formen wie Kolonien oder Suspensionen zu erhalten.
2. Isolierung von Bakterien.
3. Pflege der reinen Stammkultur und Standardkulturen.
4. Aufzählung von Bakterien in Proben.
5. Nachweis bestimmter Bakterien von Interesse in einer Probe und deren Zählung.
6. Identifizierung von Bakterien aus Kolonienmerkmalen, Wachstumseigenschaften auf Schrägen und biochemischen Aktivitäten in verschiedenen Medien.
Der Zweck dieses Experiments besteht jedoch nur darin, Bakterien aus flüssigen, festen und Oberflächenproben in festen und flüssigen Medien zu kultivieren, um sie in sichtbaren Formen als Kolonien bzw. Suspension zu erhalten.
Prinzip:
Bakterien werden in sterilisierten, nährstoffreichen, flüssigen oder festen Medien kultiviert. Das flüssige Medium, das als Bouillon bezeichnet wird, ist in Reagenzgläsern enthalten, um "Bouillonröhrchen" zu bilden, während das feste Medium, das als Agarmedium bezeichnet wird, in Petrischalen enthalten ist, um "Agarplatten" oder einfach "Platten" zu bilden. Die Kultivierung von Bakterien erfordert Material, das vermutlich Bakterien enthält.
Die meisten Dinge, die wir sehen, enthalten Bakterien. Sie sind in Zahnkratzen, Nahrungsmitteln, Böden, Wasser, Fäkalien und sogar in den nicht sterilisierten mikrobiologischen Medien selbst enthalten. Eine bestimmte Menge der homogenen Suspension eines der Bakterien enthaltenden Materials wird aseptisch in das sterilisierte Medium geimpft und 24 Stunden in einem Inkubator bei 37 ° C inkubiert.
In flüssiger Brühe wachsen die Bakterien als Suspension und machen sie trüb. Auf festen Agarplatten wachsen sie als Kolonien; Jede Kolonie wächst aus einem einzigen Bakterium. Die Kultivierung von Bakterien erfolgt in den folgenden fünf Schritten.
1. Vorbereitung der Medien
2. Sterilisation von Medien und Glaswaren
3. Beimpfung
4. Inkubation
5. Beobachtung
1. Vorbereitung der Medien:
Üblicherweise werden bei der Herstellung von flüssiger Brühe und halbfesten Medien die Bestandteile in den vorgeschriebenen Anteilen eingewogen und in der erforderlichen Wassermenge gelöst. Derzeit sind gebrauchsfertige Medienpulver erhältlich, die die Inhaltsstoffe in den erforderlichen Anteilen enthalten.
Bei der Zubereitung von flüssigen Nährmedien wird die vorgeschriebene Pulvermenge (wie auf dem Packungsetikett angegeben) eingewogen und in der erforderlichen Menge Wasser in einem Erlenmeyerkolben gelöst. Die Bestandteile werden durch Erwärmen aufgelöst, in Reagenzgläser gegossen und im Autoklaven sterilisiert.
Bei der Herstellung von festen Platten, Schrägen und tiefen Röhrchen wird die vorgeschriebene Pulvermenge (wie auf dem Packungsetikett angegeben) abgewogen und in der erforderlichen Menge Wasser in einem Erlenmeyerkolben gelöst. Dieses aufbereitete Medium wird zunächst im Autoklaven sterilisiert und dann einige Zeit abkühlen gelassen.
Noch warm, bevor es sich verfestigt, wird es in sterilisierte Petrischalen oder Reagenzgläser gegossen und beim Abkühlen auf Raumtemperatur erstarren gelassen. Medien, die sich in sehr heißem Zustand befinden, dürfen niemals in Behälter gefüllt werden, da dies zur Kondensation von Wasser an der Behälterwand führt, die auf die Oberfläche der Medien abfällt und zu deren Verunreinigung führen kann.
2. Sterilisation:
Glaswaren werden 3 Stunden in einem Heißluftofen bei 180 ° C sterilisiert und 15 Minuten bei 121 ° C (15 psi Druck) im Autoklaven behandelt. Glaswaren können auch im Autoklaven sterilisiert werden, Medien sollten jedoch niemals im Ofen sterilisiert werden, da Wasser aus den Medien austritt und austrocknet.
3. Impfung:
Es wird angenommen, dass flüssige Proben homogene Suspensionen von Bakterien sind. Für die Kultivierung in Brühe wird daher ein bestimmtes Volumen der Probe aseptisch in die Brühe pipettiert. Zur Kultivierung auf Agarplatten wird ein bestimmtes Volumen der Probe auf die feste Agarplatte pipettiert und aseptisch auf der Oberfläche des Mediums verteilt.
Für feste Proben wird eine Probe mit bestimmtem Gewicht in einem bestimmten Volumen physiologischer Kochsalzlösung (0, 85% Natriumchlorid) unter Verwendung eines sterilisierten Pistills und eines Mörsers oder eines Mischers aseptisch homogenisiert. Die meisten menschlichen Pathogene sind für den menschlichen Körper isotonisch (0, 85% Natriumchlorid).
Normalerweise beträgt das Verhältnis von Probe zu Salzlösung 1: 9 (1 g + 9 ml; 10 g + 90 ml; 25 g + 225 ml oder 50 g + 450 ml). Ein bestimmtes Volumen dieser homogenisierten Flüssigkeit, von der angenommen wird, dass sie eine homogene Suspension von Bakterien ist, wird in Reagenzgläsern für die Kultur der Brühe aseptisch zu der sterilisierten Bouillon pipettiert. Für die Kultur auf Agarplatten wird die flüssige Suspension auf die Oberfläche der Platten pipettiert und aseptisch verteilt.
Bei Oberflächenproben zur Untersuchung der Mikrobiologie fester Oberflächen (Tischplatten, Körperoberflächen oder Wunden) wird die Oberfläche mit einem sterilisierten Tupfer gerieben. Der Tupfer berührt die Oberfläche einer sterilisierten Agarplatte. Vom Berührungspunkt aus werden Streifen durch eine sterilisierte Schleife aseptisch erzeugt, um die Bakterien zu isolieren.
4. Inkubation:
Die inokulierten Bouillonröhrchen und -platten werden 24 Stunden bei 37 ° C in einem Inkubator inkubiert.
5. Beobachtung:
Trübung in flüssiger Bouillon und Kolonien auf Agarplatten deutet auf Bakterienwachstum hin.
Erforderliches Material:
Petrischalen (6 Teile), 2 ml Pipetten (5 Teile), Reagenzgläser (5 Teile), Erlenmeyerkolben (jeweils 100 ml, 250 ml und 500 ml), 250 ml Becherglas (2 Teile), Glas Spreizer, Pipettengehäuse aus Edelstahl, Kraftpapier, Faden (oder Gummiband), nicht saugfähige Baumwolle, kleine Stäbchen, Öse, Ethylalkohol, Natriumchlorid (NaCl), 0, 1 N Salzsäure (HCl), 0, 1 N Natriumhydroxid (NaOH) ), destilliertes Wasser, Nährbouillon, Nähragar, flüssige Probe (z. B. Teichwasser), feste Probe (z. B. Erde), Oberflächenprobe (z. B. Tischplatte, Körperoberfläche, Wunde), pH-Papier (oder pH-Meter), Pistill und Mörtel (oder Homogenisator), Bunsenbrenner, Heißluftofen, Autoklav, Inkubator, Laminar-Flow-Kammer.
Verfahren:
1. Fünf Pipetten (in einem Edelstahlpipettengehäuse), sechs Petrischalen und ein Paar Pistill und Mörser (oder ein Homogenisierbecher) werden bei 180 ° C für 3 Stunden in einem Heißluftofen sterilisiert. Alternativ können sie mit Kraftpapier abgedeckt, mit Faden oder Gummiband zusammengebunden und zusammen mit den Medien im Autoklaven sterilisiert werden (Abbildung 6.1).
2. 0, 85 g NaCl werden in einem 250 ml Becherglas in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und 90 ml dieser Salzlösung werden in einen 100 ml Erlenmeyerkolben gegossen. Der Mund ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.
3. Die für 100 ml der Nährlösung benötigten Bestandteile des Nährbrühenmediums werden abgewogen. Alternativ wird die vorgeschriebene Menge des fertigen Nährbrühenpulvers (Bestandteilsgemisch) abgewogen.
4. Die Zutaten (oder das fertige Pulver) werden in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wird mit einem pH-Papier oder pH-Meter bestimmt. Der pH-Wert wird mit 0, 1 N HCl auf 7, 0 eingestellt, wenn er mehr ist, oder mit 0, 1 N NaOH, wenn er geringer ist. Der Kolben wird gegebenenfalls erhitzt, um die Bestandteile vollständig aufzulösen.
5. Die Bouillon wird in 5 Teströhrchen (je ca. 10 ml) verteilt, die Mäuler verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gefesselt.
6. Die für 200 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile des Nähragarmediums oder seines gebrauchsfertigen Pulvers werden abgewogen und in 200 ml destilliertem Wasser in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst.
Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und mit 0, 1 N HCl auf 0, 1 eingestellt, wenn weniger oder weniger mit 0, 1 N NaOH. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen. Dann wird es mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.
7. Tupfer werden hergestellt, indem Baumwolle um die Spitzen kleiner Stöcke gedreht wird. Nur wenige solcher Tupfer werden mit den Baumwollspitzen nach unten in einem Reagenzglas aufbewahrt. Das Reagenzglas ist mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.
8. Der 100-ml-Erlenmeyerkolben mit 90 ml Kochsalzlösung, die 5 Reagenzgläser mit Nährbouillon, der 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 200 ml Nähragar-Medium und das Reagenzglas mit den Tupfern werden bei 121 ° C (15 psi Druck) sterilisiert 15 Minuten im Autoklaven.
9. Nach der Sterilisation werden die sterilisierten Materialien aus dem Autoklaven entnommen und einige Zeit abkühlen gelassen, ohne dass sich das Medium verfestigt. Die Kühlung des Mediums verhindert die Kondensation und Ansammlung von Wassertropfen in den Platten. Wenn das Medium bereits während der Lagerung hergestellt und verfestigt wurde, muss es durch vorsichtiges Erhitzen verflüssigt werden, bis es vollständig schmilzt.
10. Um Nähragarplatten herzustellen, bevor das sterilisierte Nähragarmedium sich abkühlt und verfestigt, wird es in warmem geschmolzenem Zustand aseptisch in die 6 sterilisierten Petrischalen (jeweils etwa 20 ml) gegossen, so dass das geschmolzene Medium den Boden bedeckt die Petrischalen komplett.
Dann werden die Platten mit ihren Deckeln bedeckt und abkühlen gelassen, um das Medium in ihnen zu verfestigen. Wasserdampf, der an der Innenfläche der Platten und Deckel kondensieren kann, wird verdampft, indem die Platten und Deckel etwa 1 Stunde lang in einem Inkubator bei 37 ° C in umgekehrter Position gehalten werden.
11. Die flüssige Probe (vermutlich Bakterien enthalten, z. B. Teichwasser) wird entnommen. Jeweils 1 ml der Proben wird aseptisch in 2 Bouillonröhrchen pipettiert (Abbildung 6.2). Die Rohre sind verwirbelt. Die flüssige Probe wird ebenfalls aseptisch auf jeweils 2 ml Agarplatten pipettiert und mit einem flammsterilisierten Glasverteiler auf der Oberfläche des Agarmediums verteilt.
Vor jeder Ausbreitung durch den Glasstreuer wird er in Alkohol getaucht und über einen Bunsenbrenner geflammt. Die inokulierten Bouillonröhrchen und -platten werden 24 Stunden bei 37 ° C in einem Inkubator inkubiert. Die Platten werden in umgekehrter Position von oben nach unten inkubiert.
12. Für die feste Probe (z. B. Erde) werden 10 g der Probe aseptisch eingewogen und im sterilisierten Stößel und Mörser oder Homogenisierbecher homogenisiert, nachdem 90 ml der sterilisierten Salzlösung aus dem 100-ml-Erlenmeyerkolben zugegeben wurden.
Diese homogene Bakteriensuspension wird wie in Schritt 11 aseptisch in 2 Bouillonröhrchen und 2 Agarplatten pipettiert und 24 Stunden bei 37 ° C im Inkubator inkubiert (Abbildung 6.2). Die Platten werden in umgekehrter Position von oben nach unten inkubiert.
13. Bei Oberflächenproben wird die Oberfläche, bei der der Verdacht besteht, dass sie Bakterien enthält (Tischplatte, Körperoberfläche, Wunde), für eine Flächeneinheit (z. B. 1 cm 2 ) markiert, die mit einem sterilisierten Tupfer gerieben wird. Der Tupfer wird auf die Oberfläche der beiden herausgelassenen Agarplatten aufgelegt.
Die Streifenbildung erfolgt aseptisch durch eine flammensterilisierte Schleife. Für die Streifenbildung werden fast parallele Linien durch die Schleife vom Tupferberührungspunkt gezogen. Diese bilden die Hauptstreifen. Nach der Flammensterilisation der Schlaufe werden sekundäre Streifen fast diagonal zu den primären Streifen gezogen. In ähnlicher Weise werden tertiäre und quaternäre Streifen aseptisch hergestellt.
14. Anschließend werden die Platten 24 Stunden lang bei 37 ° C im Inkubator in umgekehrter Position inkubiert (Abbildung 6.2).
15. Eine nicht inokulierte Agarplatte und ein nicht inokuliertes Bouillonröhrchen werden zur Kontrolle inkubiert, um eine ordnungsgemäße Sterilisation sicherzustellen, wie durch kein Wachstum in ihnen angezeigt. Dieser Schritt ist optional.
Beobachtungen (Kulturmerkmale):
Kulturbrühe:
(i) beobachtete Trübung
Wachstum hat stattgefunden. Die Wachstumseigenschaften werden wie folgt beobachtet (Abbildung 6.3).
(ein) Gleichmäßige feine Trübung: Durchgehend fein verteiltes Wachstum.
(b) Flockungsmittel: Flockige Aggregate, die überall verteilt sind.
(c) Pellicle: Dickes, padähnliches Wachstum auf der Oberfläche.
(d) Sediment: Konzentration des Wachstums am Boden der Bouillonkultur; kann körnig, flockig oder flockend sein.
(ii) keine Trübung
Es hat kein Wachstum stattgefunden. Die verwendete Probe ist bakterienfrei.
2. Spread Plate Culture:
(i) Beobachtete Kolonien:
Wachstum hat stattgefunden. Die Eigenschaften der Kolonie werden wie folgt beobachtet (Abbildung 6.3).
1. Größe: Punktgenau, klein, mittel oder groß.
2. Pigmentierung: Farbe der Kolonie.
3. Form: Die Form der Kolonie wird wie folgt beschrieben:
(ein) Rund: Ununterbrochene periphere Kante.
(b) Unregelmäßig: eingedrückte Umfangskante.
(c) Rhizoid: Wurzelähnliches Wachstum.
4. Margin:
Das Aussehen des äußeren Randes der Kolonie wird wie folgt beschrieben:
(ein) Gesamt: Scharf definiert, gerade.
(b) Lobate: Markierte Vertiefungen.
(c) Wellenförmig: Wellenförmige Vertiefungen.
(d) Serrate: Zahnähnliches Aussehen.
(e) filamentös: fadenartiger Spreizrand.
5. Elevation:
Der Grad, zu dem die Kolonie angehoben wird, wird wie folgt beschrieben:
(a) Wohnung: Höhe nicht erkennbar.
(b) Erhöht: Leicht erhöht.
(c) Konvex: Kuppelförmige Erhebung.
(d) Umbonat: Angehoben mit erhöhter konvexer zentraler Region.
(ii) keine Kolonie:
Auf der Platte hat kein Wachstum stattgefunden. Die verwendete Probe ist bakterienfrei.
3. Streifenkultur:
(i) Beobachtete Kolonien:
Wachstum hat stattgefunden. Es wird für die Kolonieeigenschaften wie oben beschrieben beobachtet.
(ii) keine Kolonie:
Es hat kein Wachstum stattgefunden: Die verwendete Oberflächenprobe ist bakterienfrei.
