Ziel ist es, verschiedene in einer gegebenen Probe vorhandene Bakterien zu isolieren und ihre Reinkulturen zu erhalten

Versuchen Sie, verschiedene Bakterien in einer bestimmten Probe zu isolieren und ihre Reinkulturen zu erhalten.

Zweck:

In der Natur vorkommende Bakterien treten nicht als ausgesonderte Arten auf, sondern als Mischpopulationen verschiedener Arten.

Um die einzelnen Bakterienarten zu untersuchen, müssen sie daher zunächst von der gemischten Population getrennt werden. Dieser Vorgang wird als "Isolierung von Bakterien" bezeichnet.

Dies wird erreicht, indem die gemischte Bakterienpopulation auf der Oberfläche eines festen Mediums in einzelne Kolonien gezüchtet wird. „Kolonien“ sind einzelne, makroskopisch sichtbare Bakterienmassen, die auf der Oberfläche eines festen Mediums gewachsen sind und jeweils die Vermehrung eines einzelnen Bakteriums darstellen.

Da jede Kolonie vom Wachstum und der wiederholten Vermehrung eines einzelnen Bakteriums herrührt, gehören alle in der Kolonie vorhandenen Bakterien zu derselben Spezies. Somit repräsentiert jede Kolonie eine sehr große Population einer einzelnen Bakterienart.

Diese Kolonien werden aseptisch in getrennte Nähragarschrägen überführt und dort wachsen gelassen. Die isolierten Bakterienarten, die getrennt auf Agarschrägen gezüchtet werden, werden als "Reinkulturen" bezeichnet. Alle 15 bis 30 Tage werden sie in frische Schräglagen überführt, damit sie ihre ursprünglichen Eigenschaften nicht aufgrund von Überfüllung, Nährstoffmangel und Ansammlung von Metaboliten verlieren.

Auf diese Weise werden Reinkulturen von Bakterien im Labor gehalten, indem sie in regelmäßigen Abständen wiederholt in frische Schrägen überführt werden. Dieser Prozess wird als "Aufrechterhaltung der Reinkultur" bezeichnet. Reinkulturen werden im Labor für die anschließende Identifizierung durch verschiedene Färbungs-, biochemische, serologische und molekulare Techniken sowie für deren zukünftige Verwendung aufbewahrt.

„Vorratskulturen“ sind Standard-Reinkulturen, deren Identifizierung international nach Gattungen, Arten, Unterarten, Typ oder Untertypen festgelegt wurde. Sie werden in international anerkannten mikrobiologischen Laboratorien gepflegt.

Andere Laboratorien können sie von diesen Laboratorien beziehen und in ihren eigenen Laboratorien als Stammkulturen aufbewahren, indem sie in regelmäßigen Abständen wiederholt in frische Schrägen überführt werden. Sie dienen zur gesicherten Identifizierung von Reinkulturen, die in diesen Laboratorien durch Vergleich ihrer Eigenschaften mit denen der Standard-Stammkulturen erhalten wurden.

Prinzip:

Die gemischte Population von Bakterien, die in einem bestimmten Material (fest, flüssig oder oberflächlich) vorhanden sind, wird auf Nähragarplatten durch Ausbreitungsplatten- oder Streifenplattenmethode gezüchtet, wie zuvor unter "Kultivierung von Bakterien" beschrieben. Jede auf einer Agarplatte gefundene isolierte Kolonie besteht aus einer Bakterienart, da jede Kolonie aus einem einzigen Bakterium wächst.

So werden Bakterien auf Agarplatten durch zwei Techniken wie folgt isoliert:

(a) Spread-Plate-Technik

(b) Streifenplattentechnik

Repräsentative Kolonien (Kolonien mit unterschiedlichen Eigenschaften) werden ausgewählt und aseptisch beimpft, um die Agarneigungen zu trennen, um die Reinkulturen zu erhalten. Nach jeweils 15 bis 30 Tagen werden sie zur Aufrechterhaltung dieser Reinkulturen in frische Schrägen überführt.

Erforderliche Materialien:

Reagenzgläser (5 Stück), 250 ml Erlenmeyerkolben (1 Stück), 0, 1 N NaOH, 0, 1 N HCl, destilliertes Wasser, Nähragar, nicht saugfähige Baumwolle, Schlaufe, Bastelpapier, Faden (oder Gummiband), pH-Papier (oder pH-Meter), Bunsenbrenner, Autoklav, Laminar-Flow-Kammer, Inkubator, Platten mit isolierten Bakterienkolonien (Ausbreitungsplatte oder Streifenplatte).

Verfahren:

1. Die für 100 ml des Mediums erforderlichen Bestandteile des Nähragarmediums oder seines gebrauchsfertigen Pulvers werden abgewogen und in 100 ml destilliertem Wasser in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben durch Schütteln und Verwirbeln gelöst (Abbildung 6.4).

2. Sein pH-Wert wird unter Verwendung eines pH-Papiers oder eines pH-Meters bestimmt und mit 0, 1 N HCl auf 0, 1 eingestellt, wenn weniger oder 0, 1 N NaOH verwendet wird.

3. Der Kolben wird erhitzt, um den Agar vollständig in dem Medium aufzulösen.

4. Bevor es sich verfestigt, wird das Medium in warmem geschmolzenem Zustand in 5 Teströhrchen (jeweils ca. 20 ml) verteilt.

5. Die Reagenzgläser sind mit Baumwolle verstopft, mit Bastelpapier bedeckt und mit Faden oder Gummiband gebunden.

6. Sie werden bei 121 ° C (15 psi Druck) 15 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert.

7. Nach der Sterilisation werden sie aus dem Autoklaven genommen und in einer schrägen Position gehalten, um das Medium abzukühlen und zu verfestigen. Diese Reagenzgläser mit verfestigtem Nähragarmedium in schrägem Zustand werden als Nähragarschrägflächen bezeichnet.

8. Die Schritte 10 und 11 sollten nach einer aseptischen Technik durchgeführt werden, vorzugsweise in einer laminaren Strömungskammer. Die Mündung der Behälter, die sterilisierte Medien oder Kulturen enthalten, sollte nach Entfernen des Wattestopfens und vor dem Zurücksetzen über dem Bunsenbrenner angezeigt werden.

Loops müssen vor der Verwendung über Flamme sterilisiert werden, indem sie auf rot erhitzt werden und dann 30 Sekunden lang gekühlt werden, um auf Raumtemperatur abzukühlen. Sie sollten niemals verwendet werden, wenn sie sehr heiß sind, da sie die Mikroben töten, wenn sie berührt werden.

9. Wenn im vorherigen Experiment isolierte Kolonien auf der Ausbreitungsplatte oder der Streifenplatte beobachtet werden konnten, werden fünf Kolonien mit unterschiedlichen Eigenschaften als repräsentative Kolonien ausgewählt.

10. Eine Schleife wird über der Flamme sterilisiert, und eine Keimschleife aus jeder der repräsentativen Kolonien wird aseptisch entnommen. Die Schleife wird in die Agar-Schräge eingeführt, so dass die Bakterienschleife bis zum Ende der Schräge geht. Die Schleife wird wellenförmig nach außen bewegt und berührt die Oberfläche der Schräge, so dass eine Wellenlinie entsteht.

11. Die Schleife wird flammensterilisiert und auf ähnliche Weise wird der Rest der vier repräsentativen Kolonien über vier Schrägen separat in den Rest inokuliert. Die Schlaufe wird nach jeder Impfung sterilisiert.

12. Die fünf inokulierten Schrägen werden 24 Stunden bei 37 ° C in einem Inkubator inkubiert.

Beobachtungen (Kulturmerkmale):

(i) Eine Wellenlinie mit wachsendem Wachstum entlang ihrer beobachteten Länge:

Wachstum hat stattgefunden.

Die Neigung wird für die Neigungseigenschaften wie folgt beobachtet (Abbildung 6.5).

1. Wachstumsfülle:

Die Wachstumsmenge wird als nicht, gering, mäßig oder groß bezeichnet.

2. Pigmentierung

Chromogene Mikroorganismen können intrazelluläre Pigmente erzeugen, die für die Färbung des Organismus verantwortlich sind, wie er in Oberflächenkolonien zu sehen ist. Andere Organismen produzieren extrazelluläre lösliche Pigmente, die in das Medium ausgeschieden werden und auch eine Farbe erzeugen. Die meisten Organismen sind jedoch nicht chromomer und erscheinen weiß bis grau.

3. Optische Eigenschaften:

Die optischen Eigenschaften können auf der Grundlage der durch das Wachstum übertragenen Lichtmenge bewertet werden.

Diese Eigenschaften werden beschrieben als:

(ein) Undurchsichtig: Keine Lichtdurchlässigkeit.

(b) Transluzent: Teillichtübertragung.

(c) Transparent: Volle Lichtübertragung.

4. Formular:

Das Auftreten des einzeiligen Wachstumsstreifens auf der Agaroberfläche wird wie folgt bezeichnet:

(ein) Filiform: Kontinuierliches, fadenartiges Wachstum mit glatten Kanten.

(b) Echinulate: Kontinuierliches, fadenartiges Wachstum mit unregelmäßigen Kanten.

(c) Perlen: Nicht konfluente bis halbkonfluente Kolonien.

(d) Effuse: Dünnes, sich ausbreitendes Wachstum.

(e) Arboreszent: Baumartiges Wachstum.

(f) Rhizoid: Wurzelartiges Wachstum.

(ii) Kein Wachstum entlang der Impflinie:

Fehlerhafte Technik der Inokulation, die Inokulation wird wiederholt. C Aufzählung der Bakterien.

C. Zählung von Bakterien:

Das Ausmaß der bakteriellen Aktivität in einer bestimmten Probe unter bestimmten Bedingungen hängt hauptsächlich von der Gesamtzahl der darin enthaltenen Bakterien ab, unabhängig von ihrer Spezies. Daher ist es häufig erforderlich, die Gesamtzahl der in Proben von Lebensmitteln, Wasser, Boden, Luft und Gewebe enthaltenen Bakterien während ihrer mikrobiologischen Analyse zu ermitteln.

Das Schätzen der Anzahl von Bakterien in einer bestimmten Probe wird als "Bakterienzählung" bezeichnet. Es gibt verschiedene Methoden zur Aufzählung von Bakterien, wie nachstehend angegeben. Bei all diesen Verfahren müssen Bakterien in einer homogenen Suspension vorliegen.

Daher wird angenommen, dass flüssige Proben homogene Suspensionen von Bakterien sind und direkt verwendet werden, während feste Proben in sterilen Salzlösungen homogenisiert werden, um homogene Suspensionen von Bakterien zu erhalten.

Wird nicht häufig verwendet:

(I) direkte Methoden:

(a) Direkte mikroskopische Zählung

(b) Elektronischer Zellenzähler

(II) Indirekte Methoden

(c) chemische Methoden

(d) Turbidimetrische Methode

(e) Membranfilterzahl

Am häufigsten verwendet:

(f) Serielles Verdünnungsagar-Plattierungsverfahren oder Total Plate Count-Verfahren (TPC-Verfahren)

(a) Direktmikroskopische Zählung:

Bei diesem Verfahren wird die Anzahl der Bakterien, die in einem Aliquot der homogenen Bakteriensuspension vorhanden sind, direkt unter einem Mikroskop gezählt und die Gesamtzahl der Bakterien in der Probe wird mathematisch bestimmt.

Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie sehr schnell ist. Die Nachteile sind, dass sowohl lebende (lebensfähige) als auch tote Zellen gezählt werden und das Verfahren nicht auf Populationen von weniger als einer Million Bakterien pro Milliliter anspricht.

Das Zählen kann auf zwei Arten erfolgen:

(i) Petroff-Hauser-Kammer:

Es ist eine spezialisierte Zählkammer, in der ein Aliquot der homogenen Bakteriensuspension direkt unter einem Mikroskop gezählt wird.

(ii) Rassenabstrich:

Bakterienzellen werden direkt unter dem Mikroskop gezählt, wobei auf einem Objektträger auf einer Fläche von 1 mm 2 gefärbte Abstriche verwendet werden. Es wird hauptsächlich zur Zählung von Bakterien in der Milch verwendet.

(b) elektronischer Zellenzähler:

Ein elektronischer Zellzähler wie "Coulter Counter" wird verwendet, um die Anzahl der Bakterienzellen direkt zu zählen. Man lßt eine homogene Suspension von Bakterienzellen, die in einer leitenden Flüssigkeit hergestellt wurden, durch eine winzige Öffnung strömen, durch die ein elektrischer Strom fließt.

Der Widerstand an der Öffnung wird elektronisch erfasst. Wenn eine Zelle durch die Öffnung geht und nicht leitend ist, erhöht sie kurzzeitig den Widerstand. Die Anzahl, wie oft die Resistenz vorübergehend ansteigt, wird elektronisch aufgezeichnet, was die Anzahl der in der Suspension vorhandenen Bakterien anzeigt.

Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie extrem schnell ist. Die Nachteile sind, dass sowohl lebende (lebende) als auch tote Zellen gezählt werden und das Instrument nicht zwischen Bakterienzellen und inerten Partikeln unterscheiden kann.

(c) Chemische Methoden

Diese Methoden schätzen die Menge dieser Substanzen, hauptsächlich Chemikalien, die mit der Zunahme der Bakterienpopulation zunimmt.

Die wichtigsten Parameter werden wie folgt geschätzt:

(i) Proteinkonzentration

(ii) DNA-Konzentration

(iii) Trockengewicht

(iv) Kohlendioxidproduktion

(v) Sauerstoffaufnahme

(vi) Milchsäureproduktion

(d) turbidimetrisches Verfahren:

Wenn Bakterien in flüssigen nährstoffreichen Medien (z. B. Nährbouillon) gezüchtet werden, werden die Medien durch ihr starkes Wachstum getrübt, da die Bakterienzellen meistens in ihnen suspendiert bleiben. Die Trübung steigt mit der Anzahl der Zellen in den Medien. Mit zunehmender Trübung steigt die Absorption oder optische Dichte (OD) des Mediums.

Die OD der Suspension von Bakterienzellen in den Medien wird mit einem Spektrophotometer bei 600 nm gemessen. Die Anzahl der Bakterienzellen in der Suspension wird durch Vergleich der OD mit einer Standardkurve ermittelt, die durch Auftragen der OD-Werte für verschiedene bekannte Bakterienkonzentrationen erstellt wurde. Die Methode ist schnell, aber auf bakterielle Suspensionen von mehr als 10 Millionen Zellen beschränkt.

(e) Membranfilterzahl:

Diese Methode wird verwendet, wenn die Anzahl der Bakterien in einer flüssigen Probe sehr gering ist. Zur Erhöhung der Bakterienkonzentration wird zunächst die flüssige Probe unter Verwendung eines sterilen Membranfilters aseptisch durch eine sterilisierte Membranfiltervorrichtung filtriert.

Der Membranfilter, der die eingeschlossenen Bakterien enthält, wird aseptisch in eine sterile Petrischale überführt, die ein absorbierendes Kissen enthält, das mit einem selektiven differentiellen flüssigen Medium gesättigt ist. Das Medium sickert auf die Oberfläche des Filters. Nach der Inkubation wird die Anzahl der auf dem Filter gebildeten Kolonien mit einem einfachen Mikroskop gezählt.

(f) Reihenverdünnungsagar-Beschichtungsverfahren oder TPC-Verfahren:

Es ist die vielseitigste und am weitesten verbreitete Methode zur Bakterienzählung.


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