Agrobacterium-vermittelter Gentransfer in Pflanzen | Biotechnologie (mit Diagramm)

Agrobacterium-vermittelter Gentransfer in Pflanzen!

Agrobacterium ist ein gramnegatives pathogenes Bakterium, das an der Entstehung einer Krongallenbildungserkrankung bei Pflanzenarten beteiligt ist. Die Kronengallenbildung beruht auf dem Transfer eines Segments onkogener (krebserregender) DNA in die Pflanzenzelle an verwundeten Stellen.

Dieses DNA-Segment (Transfer-DNA oder T-DNA) ist auf dem großen Plasmid Tumorinduzierende (Ti) -Plasmide im Bakterium vorhanden. Die T-DNA (etwa 20 kb lang) wird durch Rekombination in das Pflanzenchromosom integriert. Eine Reihe von Virulenzgenen (vir) ist an der Steuerung des Infektionsprozesses beteiligt. Wenn also eine Pflanzenwurzel oder ein Stiel verwundet wird, gibt es eine bestimmte Reaktion.

In Reaktion auf diese Signale werden die vir-Gene von A. tumefactions aktiviert und leiten eine Reihe von Ereignissen ab, die für den Transfer der T-DNA vom Ti-Plasmid auf das Chromosom der Pflanze erforderlich sind. Die Funktion verschiedener vir-Gene umfasst eine Kopie von T-DNA, gefolgt von der Anheftung eines Produkts an den kopierten T-DNA-Strang, um als Leader zu fungieren. Anschließend fügen Sie Proteine ​​zusammen mit der Länge der T-DNA hinzu, möglicherweise als Schutz Mechanismus.

Diese öffnen schließlich einen Kanal in der bakteriellen Zellmembran, durch den die T-DNA verläuft. Die T-DNA dringt dann durch die Wunde in die Pflanze ein. Es ist jedoch immer noch nicht klar, wie sich die bakterielle DNA vom Zytoplasma in den Zellkern der Pflanzenzelle bewegt oder wie die T-DNA in die pflanzlichen Chromosomen integriert wird.

Um diese Bakterien als Vektor zu verwenden, wird die T-DNA-Region mit Ausnahme der Grenzregionen und der vir-Gene entfernt. Das Transgen wird dann zwischen die T-DNA-Regionen inseriert, wo es in die Pflanzenzelle übertragen wird und in das Chromosom der Pflanze integriert wird (Abb. 1). Die T-DNA wird in Ti-Plasmide kloniert, die zurechtgeschnitten und in E. coli repliziert werden, um die weitere Manipulation zu erleichtern. Diese Vektoren werden in Agrobacterium-Wirtsstämmen mobilisiert und zur Infektion der Pflanzengewebe verwendet.

Diese infizierten Pflanzengewebe werden anschließend auf Medien gezüchtet, die spezifische Chemikalien enthalten, Wachstumsregulatoren, um die Regeneration transformierter Zellen zu erleichtern. Die Auswahl der Transformanten erfolgt in Gegenwart eines im Kulturmedium vorhandenen Antibiotikums. Die transformierten Pflanzen werden schließlich zur stabilen Integration und Funktionsanalyse des inserierten Gens analysiert.

Protoplastenfusion:

Zellen ohne Zellwand werden als Protoplasten bezeichnet. Diese Protoplasten können DNA direkt in Gegenwart bestimmter Chemikalien (wie Polyethylenglykol, PEG) aufnehmen. Eine höhere PEG-Konzentration bewirkt eine Permeabilisierung der Plasmamembran, die die Aufnahme von DNA in Protoplasten ermöglicht. Sogar elektrische Signale können verwendet werden, um durch Leiten eines elektrischen Stroms kleine Löcher in der Plasmamembran zu erzeugen.

Dies wird als Elektroporation bezeichnet. Diese kleinen Öffnungen helfen dann bei der Aufnahme von Fremd-DNA durch Protoplasten. Anschließend erfolgt die Zellwandbildung und der Beginn der Zellteilung. Die Produktion transgener Pflanzen durch direkten Gentransfer zu Protoplasten hängt jedoch von einem effizienten Protoplasten-System zur Regeneration der Pflanzen ab.

Genkanone oder biolistischer Gentransfer:

Dies ist die neueste Technik, bei der man DNA von Interesse in eine Zelle bringen kann, indem man Mikroteilchen (wie Gold oder Wolfram) mit hoher Geschwindigkeit lädt. Dieser Prozess der Lieferung von DNA wird als Bombardement bezeichnet. Innerhalb der Zelle werden DNA-Moleküle aus den Partikeln freigesetzt und schließlich wird diese DNA in das Kern- oder Organellengenom der Wirtszelle integriert.

Die Gewebe-Ex-Pflanzen werden schließlich auf Medien kultiviert, die spezifische Hormone / Antibiotika enthalten, um die transformierten Pflanzen auszuwählen. Sobald das interessierende Gen auf den gewünschten Wirt übertragen ist, muss seine stabile Integration hergestellt werden, was durch Regenerieren von Pflanzen erfolgt. Dies wird durch die Gewebekulturtechnik erreicht.

Der Prozess der Gewebekultur kann grob in vier Stufen unterteilt werden:

Stufe I:

Beinhaltet die Auswahl der geeigneten Explantate und deren Übertragung auf Nährmedium.

Stadium II:

Beinhaltet die Vermehrung von wachsendem Gewebe auf dem Vermehrungsmedium.

Stadium III:

Umfasst das Wachsen von Gewebe (Kallus) auf Medien, wo es in seine verschiedenen Teile differenzieren kann.

Stadium IV:

Umfasst die Übertragung von Pflänzchen in die natürliche Umgebung. Gene von Interesse können jedoch auf zwei Arten als Sense- und Antisense-Orientierung hinzugefügt werden. Um das Gen zu exprimieren oder zu exprimieren, kann man das Gen in Sinnorientierung bringen. Wenn man jedoch das unerwünschte Produkt oder einen Schritt auf einem biochemischen Weg blockieren möchte, kann man das Gen in eine Antisense-Orientierung bringen.